A comparative study of acoustic- and centrifugation-based cell wash

Abstract

Cell handling is an important aspect of biomedical research, as an accurate cell media composition and cell viability is paramount for successful studies. Specifically cell washing, the replacement of the liquid media in which the cells are dispersed with another liquid media, has been studied in this thesis. An acoustofluidic device called the AcouWash, by AcouSort AB, which utilizes the combination of acoustophoretic forces generated by sound with the predictable laminar flows of microfluidics, was evaluated compared with a manual three-step centrifugation cell wash. By washing 5 µm polystyrene beads in PBS (Phosphate Buffered Saline) with fluorescein and neuroblastoma cancer cells in PBS with FBS (Fetal Bovine Serum), the recovery of beads/cells and fluorescein/FBS washing efficiency of respective cell washing method was measured. The results showed that the AcouWash in terms of recovery performed at an equal level as manual centrifugation wash, with very close to 100% recovery of beads. However, in washing efficiency, it was only able to perform equal to a two-step centrifugation wash and was not quite on the same level as the three-step centrifugation wash. In terms of reproducibility, no statistically significant difference between an individual operator and multiple operators performing the manual centrifugation washes was found. Although, it is believed that this could change with a larger variety of operators and more repeats. A viability study using neutrophils was performed, where it was investigated whether the AcouWash or manual centrifugation wash could cause unintentional neutrophil activation (NET formation) or cell death. No cell death due to any of the cell washing methods was found. Depending on how the results from the neutrophil experiment is interpreted, either the AcouWash and centrifugation did not have any significant effect on neutrophil activation or, if the pooled samples results are to be believed, the AcouWash may also remove activated neutrophils (NETs) from non-activated neutrophils. This could indicate a new possible application for acoustofluidics, but further testing is needed to confirm the results. With the results from the practical work done for this thesis in conjunction with the review of other studies results, the conclusion can be that automated acoustofluidic platforms such as the AcouWash has a tremendous potential within the field of cell handling compared to manual centrifugation methods where human error and potential cell viability issues are proving harder to ignore.

Popular Abstract (Swedish)

En jämförande studie av akustisk- och centrifugeringsbaserad celltvätt
I det biomedicinska området är provröret med celler i någon vätska en klassisk bild av vardaglig forskning. För att utföra cellförsök med celler behöver man ofta flytta cellerna mellan olika vätskor eller dela innehållet i flera provrör före analys. För dessa ändamål och mer behövs praktiska verktyg för hantering av cellerna, eftersom cellerna i mikrometer-storleken inte kan plockas upp för hand som mycket annat i vår ”makro-värld”. Det finns många olika verktyg som används för cellhantering, inklusive olika typer av kromatografi, mikropipetter, flödescytometrar, centrifuger och mer. Att välja vad som ska användas för laboratoriet eller ett specifikt experiment kan vara en svår uppgift, eftersom varje verktyg har sina egna fördelar och nackdelar, vilket kan skilja sig från olika typer av cellprover.

Mikrofluidik är ett av de nyaste fälten inom cellhantering, som använder sig av förutsägbara laminära flöden för att gynna automatisering, noggrannhet och reproducerbarhet. Specifikt är automatisering av cellhantering väldigt attraktiv för forskare, eftersom det mänskliga felet är en av de största bidragsgivarna till förlust av pengar och tid. Ju färre gånger ett cellprov behöver hanteras manuellt, till exempel genom pipettering, desto mer förutsägbart och kontrollerat kan ett experiment bli. En sidoförgrening av mikrofluidik har nyligen gjort framsteg inom området för cellhantering, så kallat akustofluidik. Akustofluidik samlar kontrollen av flytande media från mikrofluidik och kontrollen av celler i det flytande mediet från akustofores. Akustofores som ett ord betyder migration med ljud. Partiklar i en vätska utsatt för ett akustiskt stående våg-fält kommer att påverkas av en kraft. Kraften kan leda till att partiklar rör sig i ljudfältet och på så sätt kan partiklar, eller celler, ”puttas” till den en önskvärd plats. Genom att applicera ett ljudfält till en mikrofluidisk kanal kan en akustofluidisk anordning flytta celler mellan de laminärt strömmande vätskorna, exempelvis för celltvätt, med användning av kraften som alstras av ljudet. Då cellerna ”puttas” in i ett annat flöde, kan cellerna i sin nya vätska åka ut genom en annan kanal än sin gamla vätska och på så sätt kan den gamla vätskan tvättas bort.

Speciellt celltvätt, ersättning av det vätskan i vilket cellerna är i med en annan vätska har studerats i denna avhandling. En akustofluidisk anordning kallad AcouWash, av AcouSort AB, utvärderades och jämfördes med en manuell tre-stegs centrifugerings-celltvätt. Genom att tvätta 5 µm stora polystyrenkulor i saltlösning med fluorescerande molekyler och cancerceller i saltlösning med protein uppmättes den bibehållna koncentrationen kulor/celler (kallat ”recovery”) och hur effektivt de fluorescerande molekylerna/proteinet tvättades bort (tvätteffektivitet) med respektive celltvättningsmetod. Resultaten visade att AcouWash i recovery presterade på samma nivå som manuell centrifugering, med mycket nära 100% recovery av polystyrenkulor. Men med tvätteffektiviteten kunde AcouWash bara prestera likvärdigt en tvåstegs centrifugeringsvätt och var inte riktigt på samma nivå som trestegscentrifugeringen. När det gäller reproducerbarhet hittades ingen statistiskt signifikant skillnad mellan en enskild operatör och flera operatörer som utför den manuella centrifugeringstvätten. Det antas dock att detta kan förändras med en större mängd operatörer och fler upprepningar. Ett experiment med användning av vita blodceller, mer specifikt neutrofiler, utfördes. Det undersöktes huruvida AcouWash eller manuell centrifugeringstvätt skulle kunna orsaka oavsiktlig neutrofilaktivering (NET-bildning) eller celldöd. Ingen celldöd på grund av någon av celltvättningsmetoderna hittades. Resultaten tyder på att AcouWash inte har någon signifikant effekt på neutrofilaktivering. Det finns även indikationer på att AcouWash kan separera aktiverade neutrofiler från icke-aktiverade neutrofiler. Detta kan indikera en ny möjlig applikation för akustofluidik, men ytterligare testning behövs för att bekräfta resultaten. Med utgångspunkt från det praktiska arbetet för denna avhandling i samband med granskningen av andra studieresultat kan man dra slutsatsen att automatiserade akustofluidiska plattformar, såsom AcouWash, har en enorm potential inom cellhantering jämfört med manuella centrifugeringsmetoder där mänskliga fel och potentiella problem med cell-viabilitet kan bli svårare att ignorera i framtiden.

• author: Linander, Oskar
• supervisor: Andreas Lenshof
• organization: Department of Biomedical Engineering
• alternative title: En jämförande studie av akustisk- och centrifugeringsbaserad celltvätt
• course: BMEM01 20182
• year: 2019
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Technology and Engineering
• keywords: Cell handling, Microfluidics, Acoustofluidics, Cell wash, Recovery, Washing efficiency, Cell viability
• language: English
• additional info: 2018-21
• id: 8964958
• date added to LUP: 2019-01-14 14:01:02
• date last changed: 2019-01-14 14:01:02