Expression and purification of Alpha-1-microglobulin-bikunin-precursor in E. coli
(2019) MOBN02 20182Degree Projects in Molecular Biology
- Popular Abstract (Swedish)
- Syntes av AMBP i E. coli
Vår kropp gör en proteinprodukt som heter Alfa-1-Mikroglobulin-Bikunin-Prekursor (AMBP) som sedan klyvs och blir två aktiva proteiner innan de lämnar cellen. Det ena proteinet kallas Alfa-1-Mikroglobulin (A1M) och det andra kallas bikunin. Dessa två proteiner kan inte syntetiseras separat, utan kommer alltid som ett paket. Dessa två proteiner har heller ingen fysiologisk gemenskap, d.v.s. de interagerar inte med varandra efter att de separeras från varandra. A1M verkar som en antioxidant och kan ta hand om giftiga ämnen i kroppen och förhindra att de kan göra oss skada, från bl.a. oxidativa ämnen. A1M kan även lindra protein, celler och vävnader i kroppen som redan har tagit skada från oxidativa attacker.... (More) - Syntes av AMBP i E. coli
Vår kropp gör en proteinprodukt som heter Alfa-1-Mikroglobulin-Bikunin-Prekursor (AMBP) som sedan klyvs och blir två aktiva proteiner innan de lämnar cellen. Det ena proteinet kallas Alfa-1-Mikroglobulin (A1M) och det andra kallas bikunin. Dessa två proteiner kan inte syntetiseras separat, utan kommer alltid som ett paket. Dessa två proteiner har heller ingen fysiologisk gemenskap, d.v.s. de interagerar inte med varandra efter att de separeras från varandra. A1M verkar som en antioxidant och kan ta hand om giftiga ämnen i kroppen och förhindra att de kan göra oss skada, från bl.a. oxidativa ämnen. A1M kan även lindra protein, celler och vävnader i kroppen som redan har tagit skada från oxidativa attacker. Bikunin har en mer passiv funktion i vår kropp. Bikunin förhindrar att dessa giftiga produkter bildas första början. Våra celler kan faktiskt själv bilda dessa giftiga substanser om våra celler får rätt signaler från vår omgivning, dessa signaler nedregleras av bikunin.
För att kunna studera denna proteinprodukt så måste vi förhindra att den klyvs på något sätt. Därför så har vi tagit DNA från genen som kodar för AMBP och satt in det i E.coli som inte har rätt verktyg för att klippa sönder proteinprodukten till A1M och bikunin. På så sätt så kan vi sätta igång ett maskineri som kan syntetisera denna proteinprodukt väldigt snabbt och sedan är det relativt enkelt att extrahera den från bakterieodlingen.
Problemet har tidigare varit att denna proteinprodukt trasslar ihop sig med varandra och skapar därför en stor proteinklump, när vi har försökt att syntetisera den utanför vår kropp. Detta har nu efter detta projekt, visat sig vara ett mindre problem genom att ändra vissa steg i proceduren av att rena fram vår proteinprodukt.
Vi börjar med att få alla bakterieceller att spricka genom att skaka dem tillräckligt snabbt, på så sätt så läcker vår proteinprodukt ut. Vår proteinprodukt är även modifierad på så sätt att vi har en specifik elektrisk laddning på ena ändan av vår proteinprodukt, som binder till nickel. Så om vi har en gel med nickel i en cylinder, så kommer vår proteinprodukt binda till denna gel. Allt annat som fanns i bakterien har alltså spolats rakt igenom och vi har endast vår rena proteinprodukt. När vi sedan extraherar vår rena proteinprodukt från nickelgelen så kommer det att vara felveckat. Proteiner har alltså en speciell konfirmation när de är funktionella proteiner. Vilket vår proteinprodukt nu inte har. Detta löser vi genom att tillsätta vår rena proteinprodukt till ett bad av olika molekyler som kommer att hjälpa vår ihoptrasslade proteinprodukt att lösa upp sig och sedan bilda rätt konfirmation. Därefter så dialyseras denna proteinlösning för att bli av med alla molekyler som hjälpte till att bilda korrekt konfirmation, så att vi bara har vår rena proteinlösning kvar igen. Denna gången så är det rättveckat och funktionellt! Det kan fortfarande finnas proteinfragment och ihoptrasslade proteinklumpar, dessa separerar vi bort genom att sätta vår proteinlösning till en cylinder med en gel som separerar enligt storlek på molekyler. Då vi vet hur stort vårt protein är i teorin, kan vi därför uppskatta när den elueras ut ur vår gelcylinder. Detta kan vi också mäta senare med en maskin som mäter hur mycket protein det finns en en vattenlösning.
För att verkligen säkerställa att vi hade vår önskade proteinprodukt så testade vi om antikroppar mot A1M och bikunin binder till vår proteinprodukt. Båda antikropparna band in till vår proteinprodukt och vi kunde därför vara säkra på att vi hade AMBP!
Både A1M och bikunin är i klinisk fas som medicin emot olika former av oxidativ stress och inflammation. Jag tror att om vi fortsätter att studera AMBP, vilket vi nu kan, så kan det leda till mer optimiserad antioxidationsmedicin och anti-inflammationsmedicin.
Masterexamensprojekt i Molekylärbiologi 45 hp 2019-03-15
Biologiska institutionen, Lunds universitet
Handledare: Maria Allhorn & Bo Åkerström
IKVL – BMC, B14, Sölvegatan 19, 223 62 Lund (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
http://lup.lub.lu.se/student-papers/record/8973186
- author
- Frank, André
- supervisor
-
- Maria Allhorn LU
- Bo Åkerström LU
- organization
- course
- MOBN02 20182
- year
- 2019
- type
- H2 - Master's Degree (Two Years)
- subject
- language
- English
- id
- 8973186
- date added to LUP
- 2019-03-19 12:10:42
- date last changed
- 2019-03-19 12:10:42
@misc{8973186,
author = {{Frank, André}},
language = {{eng}},
note = {{Student Paper}},
title = {{Expression and purification of Alpha-1-microglobulin-bikunin-precursor in E. coli}},
year = {{2019}},
}