Downstream process development for purification of a therapeutic protease

Abstract

The epidermal growth factor receptor (EGFR) is a receptor involved in cell proliferation. It is frequently overregulated in cancer cells, making it an attractive target for cancer therapeutics. One possible pharmaceutical is protease-X; a protein involved in the cleavage of the EGFR and thus, a way to regulate the receptor’s activity and lead the cancer cells to apoptosis. The aim of this thesis has been to develop a downstream process for purification of protease-X, especially with focus on two types of chromatography: immobilized metal affinity chromatography (IMAC) and ion exchange chromatography (IEX). In the development of this process, it has been seen that the sample preparation may play a big role in the outcome of the purification, especially the choice of method for disruption of cells. In IMAC it has been seen that the imidazole concentration is crucial since it greatly affects the elution of both protease-X and other proteins. In AEX, pH seems to be a very important parameter since it controls the protein’s binding strength to the column. In anion exchange chromatography, a too high pH might limit the elution of the protease while a lower pH seems to lower the purity. Overall, a yield of < 5 % was achieved in the purification, leaving room for a lot of improvement. However, the loss of protease seems to occur not only in the purification, but also due to degradation of the protein in the fermentation.
The enzyme activity has been investigated, and the main conclusion from the experiments is that the protease is very sensitive and the activity may be lost due to many different factors, such as the handling of the samples. The handling of the samples would need to be more standardized in order to eliminate the impact of other factors than the purification process itself.

Popular Abstract (Swedish)

Proteinupprening är ett viktigt och grundläggande steg för att kunna använda proteiner som läkemedel. Att utveckla en effektiv uppreningsprocess är viktigt utifrån såväl ett tidsperspektiv; som kostnads- och miljöperspektiv och målet med processen är att få ut så mycket rent protein som möjligt, utan att proteinets aktivitet reduceras. I det här projektet har en uppreningsprocess för proteas-X utvecklats; ett protein tilltänkt som cancerläkemedel. Proteas-X har mycket fördelaktiga egenskaper, såsom hög effektivitet och minskade biverkningar jämfört med de läkemedel som redan finns på marknaden.
Proteas-X har producerats av E. coli och det första steget är därför att separera proteinerna från olika cellkomponenter, vilket kräver att cellmembranet bryts upp så att proteinerna frigörs. Därefter ska proteas-X separeras från alla andra proteiner, och detta har varit fokus i det här projektet. Immobiliserad metallaffinitets-kromatografi (IMAC) och jonbyteskromatografi (IEX) är två olika sorters kromatografi med syftet att separera proteiner. Basen för både IMAC och IEX är att proteinerna färdas genom en kolonn och i kolonnen sitter kemiska grupper som proteinerna attraheras (=interagerar) till. Beroende på protein, är interaktionen olika stark, vilket gör att proteinerna kommer ut ur kolonnen vid olika tidpunkter, och således separeras. IMAC baseras på interaktionen mellan proteiner och metalljoner, och IEX baseras på interaktionen mellan laddade proteiner och motsatt laddade kemiska grupper. Vidare så kan proteinerna vara antingen positivt eller negativt laddade – beroende på pH. I IEX kan därmed grupperna i kolonnen vara antingen positivt- eller negativt laddade. Genom att variera olika parametrar påverkas separationen och syftet har varit att undersöka hur dessa kan varieras för att proteas-X ska separeras så avskilt från andra proteiner som möjligt.
Det har visats i både IMAC och IEX att proteas-X antingen interagerar för löst eller för hårt i kolonnen; två scenarion som båda gör att proteaset går till spillo. Det gäller därmed att justera parametrarna så att ett mellanting hittas och proteaset upprenas och kan samlas upp. Några metoder har uteslutits medan andra har visat potential att fungera, men det finns mer att undersöka för att fastställa exakt hur de ska användas. Till exempel visar resultatet på att det är mer fördelaktigt att utnyttja proteinernas positiva laddning i IEX och därmed en negativt laddad kolonn. Proteinaktiviteten har kort utvärderats, men det har inte gått några direkta slutsatser kring hur aktiviteten påverkas av uppreningen. Det krävs att en mer robust metod utvecklas som garanterar att proteaset behandlas likadant i alla uppreningar, som utesluter att andra faktorer än uppreningen i sig har bidragit till aktivitetsskillnaden.

• author: Lillienau, Ronja
• supervisor: Johan Svensson Bonde
• organization: Pure and Applied Biochemistry; Computational Chemistry
• course: KBKM05 20191
• year: 2019
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Technology and Engineering; Biology and Life Sciences
• keywords: Protein purification, downstream processing, preparative chromatography, immobilized metal affinity chromatography, ion exchange chromatography, applied biochemistry, tillämpad biokemi
• language: English
• id: 8982652
• date added to LUP: 2019-07-04 14:43:20
• date last changed: 2019-07-04 14:43:20