Development of a Type IIs cloning strategy for the RUBYTM format & PCR optimization and development of a Type IIs cloning strategy for pool cloning

Abstract

For Alligator Bioscience AB, a company developing immunotherapeutic antibodies, it is crucial to efficiently evaluate a large number of potential drug candidates at an early stage. The in-house developed RUBYTM concept, combining monoclonal antibodies into bispecific antibodies without lead optimization, requires implementation of high-throughput technologies. Restriction enzyme digestion, used for generating expression vectors through cloning of antibody fragments, is not suitable for high-throughput implementation. Instead, this thesis project established Type IIs cloning strategies for the RUBYTM format. Developed using a newly designed pcDNA3.4 expression vector, before utilizing the procedure for cloning of antibody fragments in pool. The pcDNA3.4 vector system was evaluated, against a previously used vector system, based on antibody production and protein characteristics. The pcDNA3.4 expression vector considerably improved antibody yield and decreased aggregation. Type IIs cloning was proven to be a viable and versatile strategy, as both PCR fragments and a donor vector could be used to achieve a high cloning efficiency. A donor vector will provide greater flexibility to future antibody development and does not require repeated amplification. The high cloning efficiency was maintained during pool cloning as well, illustrating that it is now possible to efficiently generate a greater number of antibodies in a desired format for future screenings.

Popular Abstract (Swedish)

Ditt immunförsvar kan utnyttjas för att bekämpa cancer

När det kommer till sjukdomar, orsakade av bakterier eller virus, är kroppens immunförsvar kapabelt till att själv utrota inkräktarna. Cancer däremot, är en mycket mer komplex sjukdom med förmågan att förhindra immunförsvaret från att utföra dess funktioner. Lyckligtvis har en ny kategori av läkemedel revolutionerat cancerbehandling de senaste åren, läkemedel baserade på antikroppar.

Antikroppar är proteiner som används av immunförsvaret för att identifiera och binda till sig främmande strukturer i kroppen, antingen så att andra delar av försvaret kan ingripa eller för att förhindra angriparen från att göra skada. Den här förmågan har utnyttjats för att kunna tillverka dessa proteiner och sedan administrera som läkemedel. Behandlingen kallas för immunterapi och går ut på att förbättra kroppens förmåga att själv angripa sjukdomar, exempelvis cancer. Först utvecklades monoklonala antikroppar, designade för att binda till en specifik molekyl. Efter stora framsteg och med ny kunskap inom området, kunde bispecifika antikroppar framställas. En bispecifik antikropp kan identifiera och binda två olika molekyler samtidigt, vilket teoretiskt gör det till ett effektivare läkemedel.

Mitt projekt har handlat om att förbättra processer för tillverkning och analys av potentiella bispecifika antikroppar hos Alligator Bioscience AB, ett företag som utvecklar immunterapier mot cancer. För att uppnå en effektiv framställning av antikroppar, vill man kunna utvärdera så många potentiella läkemedelskandidater som möjligt i ett tidigt skede. Alligator Bioscience har utvecklat ett nytt koncept som ska göra detta enklare, en ritning för att kunna kombinera egenskaperna hos två stycken monoklonala antikroppar till en bispecifik antikropp. Egenskapen som gör varje antikropp unik, det som bestämmer vilken molekyl den kan binda till, sitter i en specifik del av proteinet. Ritningen finns där som hjälp för att visa hur delarna ska sitta i förhållande till varandra. Den första delen av projektet gick ut på att etablera ett tillvägagångssätt för att kunna kombinera dessa byggstenar i en enda reaktion, med förhoppningen att den ska vara effektivare och producera en större mängd antikroppar än den tidigare använda metoden. Resultaten visar att den nya metoden är enkel att genomföra, kostar mindre tid samt genererar bispecifika antikroppar i större mängder och med mer fördelaktiga egenskaper.

Tänk dig att du ska bygga ett dussintal olika strukturer i lego enligt samma ritning, alla ska bestå av lika många legobitar men av olika färger. Varje struktur representerar en bispecifik antikropp enligt konceptet hos Alligator och varje färg gör antikroppen unik. Det optimala sättet att bygga alla föremål i lego hade varit att kasta ner alla legobitar i en stor säck, skaka om den några gånger, för att sedan hälla ut färdiga föremål i varje representerad färg på golvet. Det var tanken bakom den andra delen av mitt projekt, att ta den utvecklade metoden för att kunna kombinera byggstenar från flera olika reaktioner samtidigt och ändå få fram korrekta antikroppar. Det visade sig att en stor mängd antikroppar, legostrukturer, går att konstruera effektivt på det här sättet. I ett större sammanhang betyder detta att det nu finns en effektiv metod för att framställa bispecifika antikroppar enligt ett nyutvecklat koncept som ska förenkla upptäckten av nya läkemedelskandidater.

Masterexamensprojekt i Molekylärbiologi 60 hp 2019
Biologiska institutionen, Lunds universitet
Handledare: Fredrika Carlsson
Alligator Bioscience AB

• author: Petersson, Marcus
• supervisor: Fredrika Carlsson
• organization: Degree Projects in Molecular Biology
• course: MOBM02 20191
• year: 2019
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Biology and Life Sciences
• language: English
• id: 8990423
• date added to LUP: 2019-07-09 10:58:31
• date last changed: 2019-07-09 11:35:50