Construction and characterization of ApoE3-GFP as a tool to study ApoE trafficking
(2019) MOBN03 20182Degree Projects in Molecular Biology
- Abstract
- Apolipoprotein E4 (ApoE4) is the biggest genetic risk factor for Alzheimer’s disease. While it is known to transport cholesterol to neurons the localization of the protein has not yet fully been mapped. Levels of amyloid precursor protein (APP) and its cleavage product amyloid beta (Aβ), the main component of amyloid plaques, in transfected cells were determined using western blot. Green fluorescent protein (GFP) tagged ApoE was produced and further characterized using inverted epifluorescence microscopy and western blotting. Here we see a trend in reduction of APP levels with all transfected ApoE isoforms in Neuro2a (N2a) cells containing the human APP Swedish mutation. We do not see a clear trend in Aβ levels of ApoE3 and ApoE4... (More)
- Apolipoprotein E4 (ApoE4) is the biggest genetic risk factor for Alzheimer’s disease. While it is known to transport cholesterol to neurons the localization of the protein has not yet fully been mapped. Levels of amyloid precursor protein (APP) and its cleavage product amyloid beta (Aβ), the main component of amyloid plaques, in transfected cells were determined using western blot. Green fluorescent protein (GFP) tagged ApoE was produced and further characterized using inverted epifluorescence microscopy and western blotting. Here we see a trend in reduction of APP levels with all transfected ApoE isoforms in Neuro2a (N2a) cells containing the human APP Swedish mutation. We do not see a clear trend in Aβ levels of ApoE3 and ApoE4 transfected cells. ApoE3-GFP was successfully cloned and expressed in N2a mouse neuroblastoma cells. In N2a cells ApoE3, ApoE4 and ApoE3-GFP were localized near to the nuclear DAPI staining. ApoE3-GFP and ApoE3 was endocytosed by hippocampal and cortical mouse embryonic primary neurons and localized in the proximity of DAPI staining. We demonstrate that ApoE3-GFP was localized the same as the non-tagged protein. These results indicate that ApoE3-GFP maintains some of the same trafficking as ApoE3. In turn, this make ApoE3-GFP a useful tool to study ApoE trafficking. (Less)
- Popular Abstract (Swedish)
- Lysande protein ska hjälpa spåra ändringar vid alzheimers sjukdom
Demens är ett syndrom som påverkar en stor del av populationen vid högre ålder. Syndromet yttrar sig genom att påverka personers kognitiva förmågor, huvudsakligen minnet. Frekvensen kommer fortsätta att öka med den åldrande populationen. Den vanligaste och mest välkända varianten av demens är alzheimers sjukdom.
Som alla vet är det huvudsakligen äldre personer som påverkars av alzheimers sjukdom. Kanske känner just du någon som har påverkats av sjukdomen. Sjukdomen yttrar sig oftast med att sömnen blir lite sämre, man börjar glömma saker man vanligtvis kommer ihåg och ens personlighet ändras sakta. Lyckligtvis får inte alla personer alzheimers sjukdom. Man har dock... (More) - Lysande protein ska hjälpa spåra ändringar vid alzheimers sjukdom
Demens är ett syndrom som påverkar en stor del av populationen vid högre ålder. Syndromet yttrar sig genom att påverka personers kognitiva förmågor, huvudsakligen minnet. Frekvensen kommer fortsätta att öka med den åldrande populationen. Den vanligaste och mest välkända varianten av demens är alzheimers sjukdom.
Som alla vet är det huvudsakligen äldre personer som påverkars av alzheimers sjukdom. Kanske känner just du någon som har påverkats av sjukdomen. Sjukdomen yttrar sig oftast med att sömnen blir lite sämre, man börjar glömma saker man vanligtvis kommer ihåg och ens personlighet ändras sakta. Lyckligtvis får inte alla personer alzheimers sjukdom. Man har dock hittat specifika gener som ökar risken för att få sjukdomen och gör så man får den tidigare. Genen som ökar risken mest är ApoE. Vanligtvis är ApoE involverad i att transportera kolesterol i hjärnan så att våra hjärnceller kan forma nya minnen och inte skadas.
Den variant av ApoE som ökar risken mest för alzheimers sjukdom är ApoE4. Det har visats att den ej är lika bra på att bära kolesterol och kan ha direkt giftiga effekter i hjärnceller. För att kunna förstå hur ApoE4 påverkar hjärncellerna negativt måste man även veta var det transporteras.
En lysande variant av ApoE
I mitt arbete har jag byggt en variant av ApoE som lyser grönt. Genom att koppla ihop ApoE med ett protein från en självlysande manet har vi lyckats kunna se var i celler ApoE4 rör sig i celler. När man kopplar ihop proteiner med varandra är det dock möjligt att deras funktioner och transport förändras. Därför började vi med att först låta celler producera vår lysande ApoE medan vi undersökte var det transporterades med hjälp av mikroskopi. För att försäkra oss att vår lysande variant beter sig som den vanliga varianten lät vi även cellerna producera den vanliga varianten. Vi färgade sedan vanliga ApoE och upptäckte att de var på samma ställe som den lysande varianten. Detta visade sig vara sant även för hjärnceller som tog upp proteinet och ej producerade det själv.
Denna studiens mål var huvudsakligen att tillverka en variant av ApoE som kunde följas utan att färgas in. Vi lyckades producera ett sådant protein och vi såg att det gick till samma ställen i hjärncellerna som proteinet som ej var lysande. Genom att lyckas förstå var ApoE rör sig i hjärnceller kan behandlingar potentiellt skapas för att motverka de negativa förändringarna associerade med ApoE. För att nå dit behövs proteinet undersökas mer och karaktäriseras mer.
Masterexamensprojekt i Molekylärbiologi 60 hp 2019
Biologiska institutionen, Lunds universitet
Handledare: Gunnar Gouras
Institutionen för experimentell medicinsk/Experimentell Demensforskning (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
http://lup.lub.lu.se/student-papers/record/8995167
- author
- Lemland, Charley
- supervisor
- organization
- course
- MOBN03 20182
- year
- 2019
- type
- H2 - Master's Degree (Two Years)
- subject
- language
- English
- id
- 8995167
- date added to LUP
- 2019-09-17 10:02:41
- date last changed
- 2019-09-17 10:02:41
@misc{8995167,
abstract = {{Apolipoprotein E4 (ApoE4) is the biggest genetic risk factor for Alzheimer’s disease. While it is known to transport cholesterol to neurons the localization of the protein has not yet fully been mapped. Levels of amyloid precursor protein (APP) and its cleavage product amyloid beta (Aβ), the main component of amyloid plaques, in transfected cells were determined using western blot. Green fluorescent protein (GFP) tagged ApoE was produced and further characterized using inverted epifluorescence microscopy and western blotting. Here we see a trend in reduction of APP levels with all transfected ApoE isoforms in Neuro2a (N2a) cells containing the human APP Swedish mutation. We do not see a clear trend in Aβ levels of ApoE3 and ApoE4 transfected cells. ApoE3-GFP was successfully cloned and expressed in N2a mouse neuroblastoma cells. In N2a cells ApoE3, ApoE4 and ApoE3-GFP were localized near to the nuclear DAPI staining. ApoE3-GFP and ApoE3 was endocytosed by hippocampal and cortical mouse embryonic primary neurons and localized in the proximity of DAPI staining. We demonstrate that ApoE3-GFP was localized the same as the non-tagged protein. These results indicate that ApoE3-GFP maintains some of the same trafficking as ApoE3. In turn, this make ApoE3-GFP a useful tool to study ApoE trafficking.}},
author = {{Lemland, Charley}},
language = {{eng}},
note = {{Student Paper}},
title = {{Construction and characterization of ApoE3-GFP as a tool to study ApoE trafficking}},
year = {{2019}},
}