Evaluation of automated sample preparation for phosphoproteomic analysis of two different breast cancer cell lines
(2020) KIMM05 20201Department of Immunotechnology
- Abstract
- To expand knowledge on the mechanisms of breast cancer, the most prevalent cancer in women, the development of new and reliable technologies are of great interest. Phosphoproteome analysis of breast cancer cell lines can reveal important cellular processes active in different subtypes of the disease, and contribute to the understanding of breast cancer progression. Here, different sample preparation methods were assessed, and an optimized protocol is presented. This protocol combined automated protein aggregation capture (PAC), on-bead digestion and automated zirconium immobilized metal affinity chromatography (Zr-IMAC) phosphopeptide enrichment, allowing for fast, reproducible and parallel sample handling. The protocol resulted in a high... (More)
- To expand knowledge on the mechanisms of breast cancer, the most prevalent cancer in women, the development of new and reliable technologies are of great interest. Phosphoproteome analysis of breast cancer cell lines can reveal important cellular processes active in different subtypes of the disease, and contribute to the understanding of breast cancer progression. Here, different sample preparation methods were assessed, and an optimized protocol is presented. This protocol combined automated protein aggregation capture (PAC), on-bead digestion and automated zirconium immobilized metal affinity chromatography (Zr-IMAC) phosphopeptide enrichment, allowing for fast, reproducible and parallel sample handling. The protocol resulted in a high peptide recover, high phosphopeptide specificity and the identification of approximately 7 000 unique phosphopeptides in each replicate. It was implemented for differential phosphoproteome expression analysis of the breast cancer cell lines MCF-7 and MDA-MB-231, which represent two different breast cancer subtypes, identifying 1 792 differentially expressed phosphopeptides. To investigate the biological effect of the identified phosphopeptides, a pathway analysis was performed, revealing interesting changes in cancer-related mechanisms such as cell survival, avoidance of apoptosis and cell migration. Notably, the downstream signaling pathways of the nerve growth factor (NGF) receptor TrkA, showed many differentialy expressed phosphoproteins. For example of the highly significant signaling proteins AKT1 and ERK1/2 were found to be phosphorylated to a higher extent in MCF-7 and MDA-MB-231, respectively. In summary, this study included the development of a well performing automated phoshopeptide sample preparation protocol, used to identify differential expression of signaling pathways important for breast cancer in the two cell lines MCF-7 and MBA-MB-231. (Less)
- Popular Abstract (Swedish)
- Bröstcancer är den vanligaste cancerformen bland kvinnor. För att kunna utröna viktiga mekanismer involverade i uppkomsten och framfarten av bröstcancer, och därigenom kunna utveckla nya behandlingsformer, är det viktigt att ha tillgång till tillförlitliga och enkla metoder för beredning och analys av cellprover.
I Sverige förväntas uppemot var tionde kvinna att drabbas av bröstcancer innan 75 års ålder. Men bröstcancer är inte en enhetlig sjukdom, utan förekommer i flera olika former. Dessa olika typer av bröstcancer har olika sjukdomsförlopp och skiljer sig åt i vilken behandling som är mest lämplig. För att lära sig mer om vad som särskiljer de olika bröstcancerformerna, kan man till exempel studera fosforylerade proteiner.... (More) - Bröstcancer är den vanligaste cancerformen bland kvinnor. För att kunna utröna viktiga mekanismer involverade i uppkomsten och framfarten av bröstcancer, och därigenom kunna utveckla nya behandlingsformer, är det viktigt att ha tillgång till tillförlitliga och enkla metoder för beredning och analys av cellprover.
I Sverige förväntas uppemot var tionde kvinna att drabbas av bröstcancer innan 75 års ålder. Men bröstcancer är inte en enhetlig sjukdom, utan förekommer i flera olika former. Dessa olika typer av bröstcancer har olika sjukdomsförlopp och skiljer sig åt i vilken behandling som är mest lämplig. För att lära sig mer om vad som särskiljer de olika bröstcancerformerna, kan man till exempel studera fosforylerade proteiner. Proteiner utför många viktiga funktioner i kroppen och aktiviteten hos flertalet proteiner styrs genom fosforylering, vilket betyder att en fosfatgrupp binds in till proteinet. Detta fungerar som en av och på knapp för proteinerna och styr därigenom många cellmekanismer och signalvägar. Genom att studera fosforylerade proteiner i cancerceller kan man därmed komma fram till vilka funktioner som är påslagna i dessa celler.
I den här studien utvärderades olika metoder för preparering av cellprover inför analys av fosforylerade proteiner, för att uppnå ett optimalt tillvägagångssätt för provberedning. Genom att integrera flera automatiserade steg är den framtagna metoden enkel att använda och variationer mellan prover och mellan analystillfällen minskar. Denna optimerade procedur användes sedan för att jämföra förekomsten av fosforylerade proteiner i två cancercellinjer som representerar två olika typer av bröstcancer.
Cancerceller utmärker sig genom att vara väldigt snabbväxande och att ha förmågan att undvika programmerad celldöd, samt att kunna infiltrera vävnader i kroppen. I denna studie kunde vi fastställa att funktioner som dessa var aktiverade i olika nivåer i de två bröstcancercellinjerna, vilket stämmer med deras olika utmärkande cellmekanismer. Att kunna identifiera karakteristiska mekanismer som dessa öppnar möjligheter för att i framtiden kunna utveckla typspecifika behandlingar för bröstcancer. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
http://lup.lub.lu.se/student-papers/record/9007893
- author
- Andersson, Erica LU
- supervisor
- organization
- course
- KIMM05 20201
- year
- 2020
- type
- H2 - Master's Degree (Two Years)
- subject
- keywords
- Breast cancer, Phosphoproteomics
- language
- English
- id
- 9007893
- date added to LUP
- 2020-05-27 10:14:42
- date last changed
- 2020-05-27 10:14:42
@misc{9007893,
abstract = {{To expand knowledge on the mechanisms of breast cancer, the most prevalent cancer in women, the development of new and reliable technologies are of great interest. Phosphoproteome analysis of breast cancer cell lines can reveal important cellular processes active in different subtypes of the disease, and contribute to the understanding of breast cancer progression. Here, different sample preparation methods were assessed, and an optimized protocol is presented. This protocol combined automated protein aggregation capture (PAC), on-bead digestion and automated zirconium immobilized metal affinity chromatography (Zr-IMAC) phosphopeptide enrichment, allowing for fast, reproducible and parallel sample handling. The protocol resulted in a high peptide recover, high phosphopeptide specificity and the identification of approximately 7 000 unique phosphopeptides in each replicate. It was implemented for differential phosphoproteome expression analysis of the breast cancer cell lines MCF-7 and MDA-MB-231, which represent two different breast cancer subtypes, identifying 1 792 differentially expressed phosphopeptides. To investigate the biological effect of the identified phosphopeptides, a pathway analysis was performed, revealing interesting changes in cancer-related mechanisms such as cell survival, avoidance of apoptosis and cell migration. Notably, the downstream signaling pathways of the nerve growth factor (NGF) receptor TrkA, showed many differentialy expressed phosphoproteins. For example of the highly significant signaling proteins AKT1 and ERK1/2 were found to be phosphorylated to a higher extent in MCF-7 and MDA-MB-231, respectively. In summary, this study included the development of a well performing automated phoshopeptide sample preparation protocol, used to identify differential expression of signaling pathways important for breast cancer in the two cell lines MCF-7 and MBA-MB-231.}},
author = {{Andersson, Erica}},
language = {{eng}},
note = {{Student Paper}},
title = {{Evaluation of automated sample preparation for phosphoproteomic analysis of two different breast cancer cell lines}},
year = {{2020}},
}