Kloning, överuttryck och upprening av växtakvaporinet AtSIP1;1 i Escherichia coli
(2020) MOBK01 20201Degree Projects in Molecular Biology
- Abstract
- Heterologous overexpression of proteins signifies that the encoding gene of a protein in one organism is expressed in another host organism that normally does not have that gene in its genome. In basic biochemical research, this is an important method for studying various protein functions such as activity and interactions in biological processes, as well as obtaining sufficient amounts to determine protein structures. However, the expression of a foreign gene may be inefficient due to a suboptimal match with the expression machinery, or suppressed as it consumes a lot of resources. It can also be incompatible due to deleterious effects on the host's cellular functions. In addition, it may be problematic to study certain types of proteins... (More)
- Heterologous overexpression of proteins signifies that the encoding gene of a protein in one organism is expressed in another host organism that normally does not have that gene in its genome. In basic biochemical research, this is an important method for studying various protein functions such as activity and interactions in biological processes, as well as obtaining sufficient amounts to determine protein structures. However, the expression of a foreign gene may be inefficient due to a suboptimal match with the expression machinery, or suppressed as it consumes a lot of resources. It can also be incompatible due to deleterious effects on the host's cellular functions. In addition, it may be problematic to study certain types of proteins as these have properties that are difficult to handle. A class of proteins where research is very limited is membrane proteins, which include aquaporins (AQPs) that form water-permeable channels in various membranes of cells. These channels belong to the family Major intrinsic proteins (MIPs) and are particularly abundant in plants where they can be divided into three subfamilies, depending on their cellular location: Plasma membrane intrinsic proteins (PIPs), Tonoplast intrinsic proteins (TIPs), and NOD26-like intrinsic proteins (NIPs). However, a new subfamily of plant aquaporins has been discovered, which has been named Small basic intrinsic proteins (SIPs). The structure and function of SIPs have not been fully determined as it has proved difficult to overexpress members of this subfamily in previous research.
The purpose of this project was to overexpress AtSIP1;1, which is one of three SIP isoforms present in the plant Arabidopsis thaliana, in the bacterial host Escherichia coli. This was achieved by subcloning the protein encoding gene sequence into an expression plasmid, optimize the expression conditions, purify the protein and examine the isolated protein.
The outcome was that the protein could not be overexpressed in the host organism due to the use of defective materials in one of the methods, which caused problems to proceed with the project. Suggestions on updating the materials with newer ones or other types that can be used as reserves, as well as improving the work under sterile conditions have been made. For future studies, it has been proposed to include other host organisms with expression systems of varying complexity since an expression system with a simple composition in a lower organism may be very limited to be able to express a gene from a higher organism. Such expression systems involve those found in eukaryotic cells, which have a high degree of complexity and the ability to express proteins that are generally difficult to express. (Less) - Popular Abstract (Swedish)
- En ny underfamilj av cellulära vakter i växter
Heterologt överuttryck av proteiner innebär att en gen som kodar för ett protein uttrycks i en annan värdorganism som normalt inte har den genen i sin arvsmassa. Inom biokemisk forskning är detta en viktig metod för att kunna studera proteiners struktur och funktion. Tyvärr kan uttrycket av en främmande gen medföra skador på värdorganismens cellulära funktioner och även vara kostsam att utföra då det går åt mycket resurser. Dessutom kan det vara problematiskt att studera vissa typer av proteiner då dessa har egenskaper som är svåra att handskas med. En klass av proteiner med mycket begränsad forskning är membranproteiner. Dessa är kända för att ha en kontrollerad transportfunktion i celler... (More) - En ny underfamilj av cellulära vakter i växter
Heterologt överuttryck av proteiner innebär att en gen som kodar för ett protein uttrycks i en annan värdorganism som normalt inte har den genen i sin arvsmassa. Inom biokemisk forskning är detta en viktig metod för att kunna studera proteiners struktur och funktion. Tyvärr kan uttrycket av en främmande gen medföra skador på värdorganismens cellulära funktioner och även vara kostsam att utföra då det går åt mycket resurser. Dessutom kan det vara problematiskt att studera vissa typer av proteiner då dessa har egenskaper som är svåra att handskas med. En klass av proteiner med mycket begränsad forskning är membranproteiner. Dessa är kända för att ha en kontrollerad transportfunktion i celler och till denna klass hör bland annat akvaporiner.
Akvaporiner bildar kanaler i cellmembran och är främst ansvariga för transport av vatten. De tillhör en familj av transportproteiner som kallas för Major intrinsic proteins (MIPs) och finns i alla organismer. Dock förekommer de särskilt rikligt i växter där de kan delas in i tre underfamiljer, beroende på deras lokalisering i celler: Plasma membrane intrinsic proteins (PIPs), Tonoplast intrinsic proteins (TIPs) och NOD26-like intrinsic proteins (NIPs) där den sistnämnda finns i membranen i rotknölar hos sojabönor. Emellertid har en ny underfamilj upptäckts som har fått namnet Small basic intrinsic proteins (SIPs) där dessa har visat sig vara svåra att överuttrycka i tidigare forskningar.
Syftet med denna studie var att överuttrycka ett växtakvaporin ur underfamiljen SIPs från växten Arabidopsis thaliana i bakterievärden Escherichia coli. För att åstadkomma detta utnyttjades både biokemiska och molekylärbiologiska metoder där den kodande genen för proteinet isolerades, klonades och uttrycktes. I slutändan skulle proteinet renas upp och uttryckas i olika förhållanden, vilket skulle detekteras och analyseras. På grund av ett defekt material som användes i en av metoderna hann proteinet inte uttryckas och därmed kunde studien inte fullbordas. Det uteblivna resultatet kompletterades med ett annat resultat, vilket visade ett framgångsrikt överuttryck av ett humant akvaporin i en jästsvamp som värdorganism.
Förslag på korrigeringar av studien inkluderar nytt material, men även förbättringar av det laborativa arbetet under sterila omständigheter. För framtida studier föreslås om att inkludera andra värdorganismer med varierande expressionssystem då drivkrafterna och resurserna i ett expressionssystem hos en organism kan vara begränsade eller inkompatibla för att uttrycka en gen från en annan organism. Med avseende på detta kan möjligheterna för att framgångsrikt överuttrycka proteiner öka.
Att åstadkomma med att heterologt överuttrycka proteiner öppnar upp nya möjligheter inom forskningsområdet där framsteg inte har uppnåtts. I framgångsrika forskningar på akvaporiner har dessa framhävt vikten av fungerande vattenkanaler där sjukdomar så som nefrogen diabetes insipidus är associerat med defekt uttryck av akvaporin typ 2 i njurar, medan bildandet av grå starr i ögonlinser är ett resultat av muterat akvaporin typ 0.
Examensarbete för kandidatexamen i Molekylär Biologi 15 hp 2020
Biologiska institutionen, Lunds Universitet
Handledare: Urban Johanson
Avdelningen för Biokemi och Strukturbiologi, Kemiska institutionen, Lunds Universitet (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
http://lup.lub.lu.se/student-papers/record/9018201
- author
- Zhu, Johan
- supervisor
- organization
- course
- MOBK01 20201
- year
- 2020
- type
- M2 - Bachelor Degree
- subject
- language
- English
- id
- 9018201
- date added to LUP
- 2020-06-15 11:48:51
- date last changed
- 2020-06-15 11:48:51
@misc{9018201,
abstract = {{Heterologous overexpression of proteins signifies that the encoding gene of a protein in one organism is expressed in another host organism that normally does not have that gene in its genome. In basic biochemical research, this is an important method for studying various protein functions such as activity and interactions in biological processes, as well as obtaining sufficient amounts to determine protein structures. However, the expression of a foreign gene may be inefficient due to a suboptimal match with the expression machinery, or suppressed as it consumes a lot of resources. It can also be incompatible due to deleterious effects on the host's cellular functions. In addition, it may be problematic to study certain types of proteins as these have properties that are difficult to handle. A class of proteins where research is very limited is membrane proteins, which include aquaporins (AQPs) that form water-permeable channels in various membranes of cells. These channels belong to the family Major intrinsic proteins (MIPs) and are particularly abundant in plants where they can be divided into three subfamilies, depending on their cellular location: Plasma membrane intrinsic proteins (PIPs), Tonoplast intrinsic proteins (TIPs), and NOD26-like intrinsic proteins (NIPs). However, a new subfamily of plant aquaporins has been discovered, which has been named Small basic intrinsic proteins (SIPs). The structure and function of SIPs have not been fully determined as it has proved difficult to overexpress members of this subfamily in previous research.
The purpose of this project was to overexpress AtSIP1;1, which is one of three SIP isoforms present in the plant Arabidopsis thaliana, in the bacterial host Escherichia coli. This was achieved by subcloning the protein encoding gene sequence into an expression plasmid, optimize the expression conditions, purify the protein and examine the isolated protein.
The outcome was that the protein could not be overexpressed in the host organism due to the use of defective materials in one of the methods, which caused problems to proceed with the project. Suggestions on updating the materials with newer ones or other types that can be used as reserves, as well as improving the work under sterile conditions have been made. For future studies, it has been proposed to include other host organisms with expression systems of varying complexity since an expression system with a simple composition in a lower organism may be very limited to be able to express a gene from a higher organism. Such expression systems involve those found in eukaryotic cells, which have a high degree of complexity and the ability to express proteins that are generally difficult to express.}},
author = {{Zhu, Johan}},
language = {{eng}},
note = {{Student Paper}},
title = {{Kloning, överuttryck och upprening av växtakvaporinet AtSIP1;1 i Escherichia coli}},
year = {{2020}},
}