Development of a novel method to evaluate hepatobiliary drug elimination in 3D cultures of primary human hepatocytes
(2021) MOBM02 20202Degree Projects in Molecular Biology
- Abstract
- Hepatobiliary excretion can be a major clearance pathway dictating the pharmacokinetics of drugs. Quantitative prediction of human hepatobiliary excretion of drugs is thus essential in early drug development. Extrapolations from current in vitro models are challenging due to differences in expression of enzymes and transporters from native liver tissue. This study aims to utilise 3D spheroids of primary human hepatocytes as a novel in vitro model to predict human hepatobiliary clearance. First, the model was characterised with regards to viability, morphology and gene expression of 12 membrane transporters. The spheroids showed no morphological changes and stable gene expression of all but SLCO1B3 and ABCC3 for up to 21 days in culture,... (More)
- Hepatobiliary excretion can be a major clearance pathway dictating the pharmacokinetics of drugs. Quantitative prediction of human hepatobiliary excretion of drugs is thus essential in early drug development. Extrapolations from current in vitro models are challenging due to differences in expression of enzymes and transporters from native liver tissue. This study aims to utilise 3D spheroids of primary human hepatocytes as a novel in vitro model to predict human hepatobiliary clearance. First, the model was characterised with regards to viability, morphology and gene expression of 12 membrane transporters. The spheroids showed no morphological changes and stable gene expression of all but SLCO1B3 and ABCC3 for up to 21 days in culture, although with reduced viability over time. Secondly, a method for measuring hepatobiliary excretion through disruption of bile canalicular structures was developed using fluorescent substrates (CMFDA and calcein-AM). This allowed measurement of biliary excretion in the incubation medium of the spheroids which, in the case of calcein-AM, was able to be inhibited by blocking its transporter (P gp). However, it was not possible to measure hepatobiliary excretion within the spheroids. Thirdly, the developed efflux assay was implemented using an unlabelled drug (rosuvastatin) which was shown to accumulate within the spheroids but to a low extent and hepatobiliary excretion could not be measured. In summary, this study provides evidence of that 3D cultures of hepatocytes offer a promising model for studying hepatobiliary excretion but highlights that a more complex in vitro model inherently is more intricate to analyse. Thus, more needs to be understood especially with regards to cellular exposure to drugs within the spheroids and how well bile canaliculi can be disrupted (Less)
- Popular Abstract (Swedish)
- En lever i miniatyr – gör det en större skillnad?
Det är enkelt att förstå att för att ett läkemedel ska ha en önskad effekt i kroppen måste rätt mängd läkemedel vara på rätt plats i kroppen. Vad som är mer komplicerat att förstå är vad som avgör just detta. En av de faktorer som spelar en viktig roll är hur läkemedel tas bort av kroppen. Detta kan göras på en mängd olika sätt men ett av de vanligare är genom utsöndring i gallan via levern. Hur mycket av ett läkemedel som tas bort via gallan påverkar därför vilken effekt man får av ett läkemedel. Vid läkemedelsutveckling är det därför viktigt att tidigt förstå hur mycket av läkemedlet som kommer att försvinna via utsöndring i gallan.
För att tidigt kunna uppskatta detta används... (More) - En lever i miniatyr – gör det en större skillnad?
Det är enkelt att förstå att för att ett läkemedel ska ha en önskad effekt i kroppen måste rätt mängd läkemedel vara på rätt plats i kroppen. Vad som är mer komplicerat att förstå är vad som avgör just detta. En av de faktorer som spelar en viktig roll är hur läkemedel tas bort av kroppen. Detta kan göras på en mängd olika sätt men ett av de vanligare är genom utsöndring i gallan via levern. Hur mycket av ett läkemedel som tas bort via gallan påverkar därför vilken effekt man får av ett läkemedel. Vid läkemedelsutveckling är det därför viktigt att tidigt förstå hur mycket av läkemedlet som kommer att försvinna via utsöndring i gallan.
För att tidigt kunna uppskatta detta används cellodlingsmodeller av celler från levern. I de vanligaste cellodlingsmodellerna odlas cellerna på plana ytor – i 2D – vilket skiljer sig från hur cellerna vanligen växer i levern. Detta gör också att den information man kan få från dessa modeller är svår att översätt till en verklig lever. Nya cellmodeller där leverceller istället odlas i 3D, som sfäroider, har nyligen utvecklats. Dessa sfäroider bildar en lever i miniatyr där cellerna beter sig mer som i en riktig lever. Till exempel bildas fickor mellan cellerna i sfäroiderna som liknar de gallstrukturer som finns i levern. Detta projekt ämnade att karakterisera hur väl dessa gallfickor efterliknar de som finns i en vanlig lever och att utveckla en metod för att mäta läkemedelsutsöndring i dem.
För att leverceller ska kunna utsöndra läkemedel i gallan krävs transportörer, en typ av proteiner i cellmembranet som kan ta upp läkemedlet till cellen och därefter utsöndra det till gallan. Detta projekt visade att genuttrycket, vilket till stor del avgör hur mycket av proteinet som finns i cellerna, var stabilt över tid för de flesta transportörerna vilket talar för att sfäroidmodellen skulle gå att använda för att mäta läkemedels¬utsöndringen i galla.
När celler odlas i laboratorium görs detta i cellmedium, en näringslösning som håller cellerna vid liv. En förutsättning för att sfäroiderna ska skapa gallfickor är att cellmediet innehåller kalcium. För att utveckla en metod för att mäta läkemedelsutsöndringen i gallan behandlades sfäroiderna först med ett fluorescerande ämne, ett ämne som är detekterbart med ljus, som utsöndras i gallan via transportörer. Därefter placerades sfäroiderna i cellmedium utan kalcium för att därigenom öppna upp gallfickorna. Tanken var således att innehållet i gallfickorna då skulle läcka ut och det fluorescerande ämnet skulle gå att mäta i cellmediumet. Alternativt, om sfäroiderna behandlades med samma fluorescerande ämne men placerades i cellmedium med kalcium – och därmed behöll intakta gallfickor – skulle en större mängd av det fluorescerande ämnet gå att mäta i sfäroiderna. I praktiken visade det sig att det gick att mäta utsöndringen i galla genom att mäta det fluorescerande ämnet i cellmediumet men inte genom att mäta i sfäroiderna.
Då läkemedel inte är fluorescerande var nästa steg i projektet att, med en annan detekteringsmetod, testa om den utvecklade metoden gick att använda för att undersöka utsöndring i galla av vanliga läkemedel. Detta visade sig inte vara möjligt och vidare studier är därför nödvändiga för att vidareutveckla metoden och för att fullt ut förstå hur cellmodellen fungerar.
Mastersprojekt i molekylärbiologi, 30 poäng, 2021
Naturvetenskapliga fakulteten, Lunds universitet
Handledare: Anna Vildhede
DMPK, Early CVRM, AstraZeneca (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
http://lup.lub.lu.se/student-papers/record/9043362
- author
- Andersson, Hampus
- supervisor
- organization
- course
- MOBM02 20202
- year
- 2021
- type
- H2 - Master's Degree (Two Years)
- subject
- language
- English
- id
- 9043362
- date added to LUP
- 2021-04-26 12:22:21
- date last changed
- 2021-04-26 12:22:21
@misc{9043362,
abstract = {{Hepatobiliary excretion can be a major clearance pathway dictating the pharmacokinetics of drugs. Quantitative prediction of human hepatobiliary excretion of drugs is thus essential in early drug development. Extrapolations from current in vitro models are challenging due to differences in expression of enzymes and transporters from native liver tissue. This study aims to utilise 3D spheroids of primary human hepatocytes as a novel in vitro model to predict human hepatobiliary clearance. First, the model was characterised with regards to viability, morphology and gene expression of 12 membrane transporters. The spheroids showed no morphological changes and stable gene expression of all but SLCO1B3 and ABCC3 for up to 21 days in culture, although with reduced viability over time. Secondly, a method for measuring hepatobiliary excretion through disruption of bile canalicular structures was developed using fluorescent substrates (CMFDA and calcein-AM). This allowed measurement of biliary excretion in the incubation medium of the spheroids which, in the case of calcein-AM, was able to be inhibited by blocking its transporter (P gp). However, it was not possible to measure hepatobiliary excretion within the spheroids. Thirdly, the developed efflux assay was implemented using an unlabelled drug (rosuvastatin) which was shown to accumulate within the spheroids but to a low extent and hepatobiliary excretion could not be measured. In summary, this study provides evidence of that 3D cultures of hepatocytes offer a promising model for studying hepatobiliary excretion but highlights that a more complex in vitro model inherently is more intricate to analyse. Thus, more needs to be understood especially with regards to cellular exposure to drugs within the spheroids and how well bile canaliculi can be disrupted}},
author = {{Andersson, Hampus}},
language = {{eng}},
note = {{Student Paper}},
title = {{Development of a novel method to evaluate hepatobiliary drug elimination in 3D cultures of primary human hepatocytes}},
year = {{2021}},
}