Detection of allele-specific expression of TLR2 in a wild rodent using Real-Time qPCR and TaqMan probes

Popular Abstract (Swedish)

Förändrat uttryck av den muterade immunförsvars-genen TLR2 kan bidra till ökad resistens mot borrelia – en studie på immunförsvaret hos vilda gnagare

Skogssorkar (Myodes glareolus) och andra vilda gnagare utgör de huvudsakliga bärarna av bakterien Borrelia afzelii. Dessa bakterier kan orsaka sjukdomen borrelia och sprids vanligen från gnagare till andra däggdjur via fästingar. Trots att sorkarna själva bär på höga halter av borreliabakterier klarar sig de flesta från infektion och sjukdom. Denna förmåga bygger bland annat på att immunförsvarets vita blodkroppar känner igen borreliabakterierna med hjälp av receptorer. En muterad variant av en receptor som heter Toll-like receptor 2 (TLR2) gör sorkarna mer resistenta mot infektion av B. afzelii. Varför denna mutation bidrar till ökad motståndskraft är ännu inte klarlagt. I den här studien undersöker vi om mutationen orsakat en förändring i produktionen (minskad eller ökad) av dessa borreliareceptorer. Av sju undersökta sorkar uppvisade en individ förändrad produktion för den icke-muterade receptorn. Detta resultat är i motsats till tidigare studier och indikerar att skogssorkens produktion av receptorer är kontextberoende.

Bakgrund
Däggdjurens immunförsvar

Människans, skogssorkens och alla andra däggdjurs immunförsvar kan liknas vid en armé beståendes av olika förband där det medfödda försvaret är infanteriet vid frontlinjen, medan det adaptiva, det vill säga det immunförsvar man bygger upp under sin livstid, är artilleriet. Ett koordinerat samband mellan dessa förband utgör den huvudsakliga kampen mot infektiösa mikrober som virus, bakterier, svamp och andra parasiter. När patogener (sjukdomsalstrande mikrober, pathos "lidande", genēs "frambringare av") som bakterier och virus, tar sig in i kroppens vävnader via till exempel sår eller slemhinnor, stöter de på det medfödda immunförsvarets vita blodkroppar. De vita blodkropparna känner igen patogenerna på små mikroskopiska strukturer som finns på deras cellytor. Dessa strukturer är unika för mikrober och skiljer från de som finns på kroppens egna cellytor. När denna förmåga att kunna skilja kroppseget från främmande inte fungerar, finns det risk att immunförsvaret attackerar den egna kroppen och autoimmuna sjukdomar utvecklas. Vid lyckad igenkänning utför de vita blodkropparna en samlad attack tillsammans med det adaptiva immunförsvaret för att snabbt och effektivt förgöra patogenerna innan de hinner sprida sig (Abbas & Lichtman 2019, s. 27-52).

Receptorer - funktion, diversitet och historia

Den funktion som tillåter de vita blodkropparna att känna igen mikrober går via receptorer. Dessa receptorer finns bland annat på de dendritiska cellerna, vilka är långsamma patrullerande vita blodkroppar som finns innanför kroppens yttersta barriärer, till exempel under huden. Receptorerna på dessa kan liknas vid avlånga strukturer utstickande från cellytan (Figur 1.). Längst ut på dessa strukturer finns en kontaktyta med en genetiskt förutbestämd struktur. Strukturen på dessa kontaktytor passar specifikt med en motsvarande på mikroben, ungefär som två pusselbitar. När sådana matchningar sker skickar receptorerna ut signaler i kroppen som leder till en immunförsvarsrespons. Denna respons innefattar bland annat en massiv rekrytering och förökning av diverse olika vita blodkroppar som till exempel neutrofiler och makrofager som tar död på patogenerna (de senare är kända för att sluka bakterier hela). Dessa vita blodkroppar cirkulerar vanligtvis i ett inaktivt stadium i kroppens blodkärl, men aktiveras i samband med rätt signal från de dendritiska cellerna, en process som kan liknas vid att kavalleriet kallas in. Utöver dessa aktiverar även den dendritiska cellen det adaptiva immunförsvaret, det vill säga T-celler och B-celler som står för både antikroppsproduktion och immunologisk minne. Antikropparna hjälper de tidigare nämnda vita blodkropparna att ta död på virus och bakterier. Vid upprepad exponering av patogenen kan minnescellerna skapa antikroppar redan en till två dagar efter infektionstillfället, vilket annars tar ungefär fem till sju dagar, och vi blir friska fortare (Abbas & Lichtman 2019, s. 27-52 och 103-105).

Det medfödda immunförsvaret består av ett flertal olika sorters vita blodkroppar med olika funktion, vissa är till exempel specialiserade på virus medan andra är effektiva mot bakterier. Utöver dessa finns det även tusentals olika receptorer som alla känner igen en unik struktur vardera. Bakgrunden till denna enorma variation finns dels i däggdjurens evolutionära historia men beror också till stor del på den enorma diversitet av bakterier, virus, svamp och andra mikrober som finns på jorden. Många av alla dessa mikrober, både i vattnet och på jorden, lever ofta i eller på andra organismer i olika former av symbios, vilken kan vara både gynnsam och förödande för värden. Bakterier lever på i princip alla flercelliga organismer som djur, växter och svampar men är även själva värdar till vissa typer av virus. Det finns dock inga dokumenterade organismer som lever på virus, vilket bland annat beror på att de är mycket mindre till storleken än de tidigare nämnda organismerna. Dessutom räknas inte virus som ”levande” enligt den biologiska definitionen av liv, eftersom de saknar förmågan till egen metabolism och kan endast föröka sig med hjälp av andra celler. Med anledning av denna stora variation är det kanske inte förvånande att många av de ämnen, celltyper och andra komponenter som utgör däggdjurens medfödda immunförsvar återfinns i princip alla jordens djur. Vi delar till exempel ett visst antal immunförsvars-komponenter och gener med flugor, kräftor, fåglar, ödlor, svampdjur med flera och även vissa antimikrobiella substanser med växter. Detta betyder att det medfödda immunförsvarets evolutionära historia hos däggdjur, går minst lika långt bak i tiden som de första växterna på jorden för mer än 400 miljoner år sedan. Det adaptiva försvaret (även kallat specifika) har till uppgift att producera antikroppar och minnesceller. Detta system är unikt för alla ryggradsdjur, där bland annat fiskar, kräldjur, fåglar och däggdjur ingår. Ett lustigt undantag är dock pirålen, en käklös fisk vilken parallellt med ryggradsdjuren utvecklat ett helt eget adaptivt immunförsvar. Denna förmåga till minne och antikroppar är en av många viktiga egenskaper som lett till att dessa djur haft stora framgångar på vår planet. Bakterier å andra sidan, har faktiskt också en typ av immunologiskt minne som hjälper dem att komma ihåg de virus som de blir infekterade av, detta system är dock långt ifrån lika avancerat som ryggradsdjurens (Humphrey & Scott, 2021; Abbas & Lichtman 2019, s. 27-52 och 103-105).

Studien

Bakgrund, metod och frågeställning

I min studie har jag undersökt en receptor hos vild skogssork (Myodes glareolus) vilken känner igen bakterien B. afzelii. Denna bakterie sprids från skogssorken via fästingar till andra däggdjur och kan orsaka sjukdomen borrelia (lyme borreliosis), viken vi i Sverige är välbekanta med under sommarhalvåret. Skogssorkar är Europas vanligaste däggdjur och således en stor spridare av borrelia. Det intressanta med skogssorken är att de har ett högt antal av borreliabakterier, men förblir oftast själva friska (Råberg, 2012). Denna upptäckt har lett till många år av studier på sorkens immunförsvar där man försöker ta reda på varför sorkarna inte blir sjuka. Ett stort intresseområde har varit den ovannämnda receptorn, alltså den som kände igen borreliabakterier. Denna receptor kallas ”Toll like receptor 2” eller ”TLR2” och finns hos de flesta djur inklusive människan. Under evolutionens gång har skogssorkens TLR2-gen muterats och fått förändrade egenskaper. Bland dessa nya muterade gen-varianter finns två stycken vanligt förekommande som vi kan kalla Gen-variant 1 (G1) och Gen-variant 2 (G2). I princip alla däggdjur har i normalfall två kopior av varje gen, vilket även gäller TLR2-genen hos skogssork. De sorkar som bär på två kopior av varianten G2 (G2/G2) har vistats ha en lägre risk för att få en borreliainfektion jämfört med de som bär på två kopior av G1 (G1/G1). Vidare visade det sig även att de sorkar som har en kopia av vardera receptor (G1/G2) också är mer resistenta än de som har två kopior av G1 (Tschirren et al., 2013).

Varför ger då den ena muterade receptor-genen (G2) bättre skydd mot borrelia? Svaret på denna fråga är ännu inte klarlagt, men det finns två huvudsakliga teorier. Den första är att den muterade receptorn som G2-genen kodar för har fått en förändrad struktur som gör att den passar bättre med motsvarande struktur på borreliabakterierna, ungefär som pusselbitsprincipen beskriven ovan. Den andra teorin är att ytterligare en mutation är kopplad till G2-genen, vilken orsakar att genen uttrycks mer, det vill säga produktionen av TLR2-receptorer har ökat. Detta skulle till exempel kunna medföra att sannolikheten att de vita blodkropparna träffar på bakterierna ökar. I min studie undersöker jag om den andra mutationen på G2 orsakat en förändring i produktionen (uttrycket) av TLR2. Jag undersöker detta genom att använda mig av PCR. Denna teknik är till för att skapa miljontals kopior av en bit arvsmassa, som till exempel en gen. När en organism uttrycker en gen betyder det att organismen producerar en produkt som genen kodar för, till exempel producerar G2-genen produkten TLR2. När genens kod (DNA) läses av produceras först en annan typ av arvsmassa kallad RNA. Detta RNA kan sedan kroppens celler åter igen läsa av och omvandla till färdiga produkter, som receptorer och andra viktiga komponenter i cellerna. Detta betyder då att om vi har en sork där G2 uttrycks mer än G1, kommer det finnas en högre koncentration av RNA som motsvarar G2 i denna individ. Om jag då vill mäta detta behöver jag ta hjälp av PCR-teknik, eftersom det är svårt att räkna något så smått som RNA-molekyler för hand. Tack vare PCR kan jag skapa miljontals kopior av detta RNA och sedan med hjälp ut av maskinen mäta vilken jag producerat mest ut av efter en viss tid. Om det fanns mer G2-RNA från början kommer PCR-maskinen upptäcka detta och jag kan på så vis se om uttrycket mellan gen-varianterna skiljer åt.

Resultat och sammanfattning

Resultatet från min studie visade att en av sju undersökta sorkar hade en större mängd receptorer producerad av G1, det vill säga det fanns högre koncentrationer av G1-RNA i denna individ än G2-RNA. Detta är i kontrast till den tidigare studien där man visat att sorkarna hade högre halter av G2-RNA. En möjlig förklaring till utfallet kan vara att sorkarna i den tidigare studien fångats i augusti medan mina togs in i november. Kompositionen och antalet av olika typer av mikrober i naturen kan skilja mellan olika säsonger. På sommaren är mängden mikrober generellt högre än på hösten och vissa typer av till exempel bakterier, svamp och virus är olika vanliga beroende på årstiden. Därför kan det motsatta resultatet eventuellt förklaras med att sorkarna i den tidigare studien haft en större belastning av borreliabakterier än majoriteten av mina. Detta kan ha orsakat att augusti-sorkarna haft en högre grad av aktiverade vita blodkroppar jämfört med november-sorkarna, vilket i sin tur gjort det möjligt att studera den muterade TLR2-receptorn på ett mer representativt sätt.

Sammanfattningsvis visade vi i denna studie att PCR-metoden fungerar väl för den här typen av analys. Resultatet är dock tvärtemot tidigare och vi kan därför inte dra några slutsatser gällande de två teorierna. För att undersöka varför den muterade TLR2-receptorn i skogssork ger ett bättre skydd mot borrelia skulle en likadan PCR-studie behöva genomföras på sorkar fångade i augusti. En sådan studie skulle förhoppningsvis avslöja om produktionen av den muterade TLR2-receptorn hos skogssorkar är förändrad eller inte.

Examensarbete i biologi 30,0 hp 2021
Biologiska institutionen, Lunds universitet

Handledare: Lars Råberg
Biologiska institutionen, Lunds universitet
Examensarbete 30,0 hp

• author: Heurgren, Max
• supervisor: Lars Råberg
• organization: Degree Projects in Biology
• course: BIOY01 20211
• year: 2021
• type: M2 - Bachelor Degree
• subject: Biology and Life Sciences
• language: English
• id: 9064172
• date added to LUP: 2021-08-30 13:00:47
• date last changed: 2021-08-30 13:16:32