Detection of cyclic dimeric guanosine 3’,5’- monophosphate (c-di-GMP) at single cell level: evaluating the CensYBLBsu c-di-GMP sensor for use in Bacillus subtilis
(2022) MOBK01 20212Degree Projects in Molecular Biology
- Popular Abstract (Swedish)
- Detektera c-di-GMP med biosensorerna CensYBL och CensYBLBsu
En viktig molekyl som kontrollerar och signalerar för olika funktioner och processer hos bakterier, heter Bis-(3’,5’) -cyklisk di-guanosin-monofosfat (c-di-GMP). Projektet gick ut på att detektera nivåer av c-di-GMP i två olika bakterier med hjälp av två olika biosensorer. I Escherchia coli testades biosensorn CensYBL och i Bacillus Subtilis användes biosensorn CensYBLBsu och testades. Den sistnämna biosensorn är en optimerad version av CensYBL.
Dessa biosensorer är designade på samma sätt med två fluorescerande fragment som är bundna till två monomerer av en molekyl. Om c-di-GMP finns i cellen, så binder c-di-GMP till monomererna, som är två delar av en molekyl och då sker... (More) - Detektera c-di-GMP med biosensorerna CensYBL och CensYBLBsu
En viktig molekyl som kontrollerar och signalerar för olika funktioner och processer hos bakterier, heter Bis-(3’,5’) -cyklisk di-guanosin-monofosfat (c-di-GMP). Projektet gick ut på att detektera nivåer av c-di-GMP i två olika bakterier med hjälp av två olika biosensorer. I Escherchia coli testades biosensorn CensYBL och i Bacillus Subtilis användes biosensorn CensYBLBsu och testades. Den sistnämna biosensorn är en optimerad version av CensYBL.
Dessa biosensorer är designade på samma sätt med två fluorescerande fragment som är bundna till två monomerer av en molekyl. Om c-di-GMP finns i cellen, så binder c-di-GMP till monomererna, som är två delar av en molekyl och då sker en strukturförändring. När en strukturförändring sker, blir monomeren en dimer och de fluorescerande fragmenten förs ihop. Detta leder till en fluorescerande signal, som kan utläsas i ett fluorescerande mikroskop.
Metod
Jag testade nivåerna av c-di-GMP genom att först växa E. coli med biosensorn som har två versioner, en aktiv och en inaktiv. Under bakteriernas tillväxt tillsattes olika substanser med olika tidsintervall. Proverna togs ut vid olika tidpunkter och analyserades i ett fluorescensmikroskop. I det fluorescerande mikroskopet kan man se om signal uttrycks eller inte. Oavsett om signal uttrycks eller inte, togs bilder. Dessa bilder analyserades i ett program som kallas Fiji, för att få fram förhållandet mellan två signalmolekyler. Dessa signalmolekyler är YFP, som är ett fluorescerande protein, och mCherry som är en kontroll sekvens. När biosensorn i B. subtilis testades, klipptes ett fragment med specifikt önskade egenskaper ut från en plasmid (DNA molekyl). Detta fragment klistrades in i plasmiden som innehåller den optimerade biosensorn. Denna plasmid tas upp av B. subtilis och får tillväxa. Detta testas på samma sätt som tidigare i det fluorescerande mikroskopet.
Resultat
Resultatet som visades är ett förhållande mellan YFP och mCherry, som indikerar c-di-GMP nivåerna i cellen (figur 1). Förhållandet mellan YFP och mCherry har större i de aktiva proverna än i de inaktiva proverna. Detta indikerar att biosensorn, CensYBL, fungerar i E. coli för att detektera nivåer av c-di-GMP. För den andra biosensorn, CensYBLBsu, gavs liknande resultat i E. coli. De aktiva proverna gav utslag och förhållandet mellan YFP och mCherry var stort, vilket indikerade att biosensorn kan detektera c-di-GMP nivåer. Detta hann dessvärre inte testas i B. subtilis. Den optimerade biosensorn kom senare än planerat vilket gjorde att det experimentet aldrig hann utföras.
Handledare: Claes von Wachenfeldt & Judith Matavacas
Examensarbete 15hp i molekylärbiologi 2021–2022
Biologiska instutionen, Lunds universitet (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
http://lup.lub.lu.se/student-papers/record/9077609
- author
- Kennestig, Alma
- supervisor
- organization
- course
- MOBK01 20212
- year
- 2022
- type
- M2 - Bachelor Degree
- subject
- language
- English
- id
- 9077609
- date added to LUP
- 2022-03-24 15:32:14
- date last changed
- 2022-03-24 15:32:14
@misc{9077609, author = {{Kennestig, Alma}}, language = {{eng}}, note = {{Student Paper}}, title = {{Detection of cyclic dimeric guanosine 3’,5’- monophosphate (c-di-GMP) at single cell level: evaluating the CensYBLBsu c-di-GMP sensor for use in Bacillus subtilis}}, year = {{2022}}, }