Development of a qPCR protocol for the quantification of Chlamydomonas sp. & Microglena sp. in Krageholmssjön

Abstract

The unicellular green alga of genus Chlamydomonas are well studied within the fields of photosynthesis and flagellar research. Although many molecular tools have been developed for use on Chlamydomonas, little research has been done on its ecology and population dynamics. Species within the genus are morphologically indistinguishable using light microscopy and as such a molecular method is necessary for their quantification and study.

In this study, a molecular method was developed with the goal of reliably quantifying target species Chlamydomonas sp. (haplotype Kgh01) and Microglena sp. (haplotype Erk02). This was done using qPCR - designing primers targeting the 18S rRNA gene and the internal transcribed spacer region sequences ITS1 and ITS2. Out of 9 primer pairs designed, one allowed specific amplification of the target sequence (KghITSP3). This pair was utilized in a qPCR reaction that was subsequently optimized in regards to annealing temperature and primer concentration. A method for cell harvesting and DNA extraction was found. Using the viable primer pair and template DNA extracted from known numbers of cells, a qPCR quantification standard was developed, coupling cell number to fluorescence measured. It was evident after testing that primers targeting Microglena 18S rRNA gene sequence were unsuccessful in efficiently amplifying the target sequence. The development of a quantification method for this species is left to future studies.

The standard developed for Chlamydomonas was estimated to have a sensitivity of between 40000 and 4000 cells/liter. This sensitivity is suboptimal, as either a contaminant or primer-dimers were found present at high cycle numbers for low cell number samples. Further optimization could increase sensitivity by reducing the amount of primer-dimer formation.

A reliable molecular method for quantifying the species of Chlamydomonas and Microglena would be extremely useful for furthering knowledge about their population ecology and for establishing population bottlenecks. This in turn would help increase understanding of the important effects they have on their habitats and on phenomena such as algal blooming.

Popular Abstract (Swedish)

Alg som alg - eller?

Grönalger är en mångfaldig grupp av primärproducenter som utgör bottennivån av de ekosystem som de är en del av. Dessa organismer binder kol med hjälp av solens energi - djurplankton äter upp grönalgerna - små fiskar äter djurplankton, och så vidare. Skulle något påverka populationen av grönalger riskerar denna påverkan att skapa en kaskadeffekt som påverkar varje steg i näringskedjan. För att bättre kunna förstå vad det är som händer med algerna i en sådan situation behöver vi få insikt i hur alger interagerar mellan arter. Problemet som vi då möter är att många av de arter som finns i våra vattendrag är närstående genetiskt och extremt svåra att skilja via deras utseende.

Men året är 2022 och vi är mitt i genrevolutionen. Molekylära metoder tar oss längre än någonsin förut. En central metod för undersökning av dessa svårskiljda arter är qPCR. Detta är en förlängning av den vanliga PCR reaktionen där man med hjälp av enzymer och korta DNA bitar (primers) specifika för ditt din målsekvens kan multiplicera mängden DNA man har tillgängligt. qPCR skiljer sig genom att man tillför en färg som lyser när den kommer i kontakt med dubbelsträngat DNA. På detta sett går det att kvantifiera mängden DNA efter varje cykel av reaktionen.

Över detta projekt utvecklade jag en metod för att kvantifiera två arter, en av släktet Chlamydomonas och en av det genetiskt närstående släktet Microglena. Eftersom Chlamydomonas är en modellart och dess flageller och fotosyntes har studerats över årtionden finns en bra grund för att utveckla metoder för släktet. Under utvecklandet designade jag primers specifika för arterna, varav de för arten i släkt Microglena ej fungerade. Jag hittade en pålitlig metod för skördandet av celler och för extraherandet av DNA. Den slutliga produkten är en så kallad qPCR kvantifierings-standard. Denna gör det möjligt att koppla den mängd ljus som kommer från den lysande färgen till en mängd celler. Och helt plötsligt kan man genom detta räkna mängden av en art som inte går att skilja ur mängden.
Standarden jag utvecklade integrerar och kompenserar för de systematiska fel som uppstår i metoden fram till själva qPCR-reaktionen. Detta inkluderar förluster av material i cellskörd och DNA-extraktion. Standarden visade sig kunna detektera celler med hög trovärdighet ner till en koncentration på mellan 40000 och 4000 celler per liter.

Med en effektiv metod för kvantifiering av Chlamydomonas kan dess ekologi förstås på en högre nivå och deras populationsfluktuationer kan dokumenteras.

Masterexamensprojekt i Molekylärbiologi 30hp 2022
Biologiska institutionen, Lunds universitet
Handledare: Karin Rengefors & Hannah Blossom
Akvatisk ekologi

• author: Klinghammer, Fredrik
• supervisor: Karin Rengefors
• organization: Degree Projects in Molecular Biology
• course: MOBM02 20221
• year: 2022
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Biology and Life Sciences
• language: English
• id: 9103291
• date added to LUP: 2022-11-17 11:07:49
• date last changed: 2022-11-17 11:07:49