A Novel Approach for Fluorescent Peptide Labeling – Synthesis and Spectroscopic Studies of Model Compounds

Abstract

Peptides are abundant in all living organisms and essential to many cellular functions. For this purpose,
peptides are interesting research targets. The chemical moieties and molecules that are involved in
peptide interactions and systems, respectively, are intrinsically non-emissive or weakly emissive, which
is why researchers have found strategies for labeling peptides. Today, peptides are typically labeled by
incorporating a non-natural fluorescent amino acid or by attaching a fluorophore to the C-terminus or
N-terminus of the peptide. These fluorophores tend to be rigid, big, and hydrophobic consequently,
implying a risk of interfering with the properties of the molecule to be labeled. The first part of the study
aimed to contribute to the development of a new class of fluorophores based on the chromophore in the
green fluorescent protein (GFP). The target compounds, with one amino acid residue flanking each side
of the fluorophore core structure, or one amino acid residue flanking the C-terminal side of the
fluorophore core structure, respectively, were synthesized in three or four steps; oxazolone synthesis,
ring-opening, dehydrative cyclization, followed by deprotection and acetylation. It was concluded that
the synthetic pathway was feasible but resulted in low overall yields despite the optimization of the
individual synthetic steps. Based on the successful synthesis of a compound containing one alanine
residue on each side of the fluorophore (i.e. an alanine-alanine model dipeptide), the synthetic route is
expected to be useful for the synthesis of dipeptide moieties of a majority of the standard amino acids.
The second part of the study aimed to investigate the photophysical properties of the synthesized
compounds. All compounds displayed solvatochromic behavior and higher emission maxima were
generally obtained in polar solvents, with the highest being associated with the probes having amino
acid flanking the C-terminal. The results from the project provide a basis for future development and
applications concerning this novel tool for fluorescent peptide labeling.

Popular Abstract (Swedish)

När man ska utveckla ett nytt läkemedel är det viktigt att förstå var i kroppen det kommer att
befinna sig samt hur det kommer att interagera med andra molekyler. I denna rapport är det just
dessa två utmaningar som adresseras. Med dagens stora fluorescerande taggar kan peptider
studeras, men i begränsad utsträckning då de förändrar peptidernas struktur vilket kan ändra
derasfunktion. Utveckling av nya, små fluorescerande taggar och metoder för att fästa eller infoga
dessa är därav avgörande för framtida grundläggande och fördjupande forskning på peptider.
Detta i det större syftet att förstå peptiders roll i såväl den friska som den sjuka människan och
vara till nytta för prevention och behandling av sjukdomar.

Fluorescensspektroskopi och -mikroskopi kan användas för att på molekylär nivå få förståelse
för hur biologiska och kemiska processer och system fungerar. Ofta kräver detta att en eller flera så
kallade fluorescerande taggar fästs på utvalda molekyler. När en fluorescerande tagg bestrålas med ljus
så kommer den att lysa, vilket gör att märkta molekyler kan lokaliseras. Förståelse om dess funktion och
interaktion med andra molekyler kan på så vis erhållas. För märkning av peptider med fluorescerande
taggar används idag organiska fluoroforer som kännetecknas av att vara stora och hydrofoba. Detta
riskerar att förändra den studerade peptidens egenskaper och funktioner och därmed ge ett missvisande
resultat. Det finns därför behov av att utveckla nya fluorescerande taggar och sätt att inkorporera dessa
i peptider. En möjlig startpunkt är kromoforen (den strukturella enhet som absorberar synligt ljus) i
proteinet känt som Green Fluorescent Protein (GFP), vars upptäckt och tillämpning som fluorescerande
tagg tilldelades nobelpriset i kemi år 2008. I detta projekt undersöktes en metod för framställning av
modellmolekyler bestående av en av tre utvalda analoger till GFP-kromoforen. Metoden bestod i
huvudsak av tre reaktionssteg; framställning av en ringstruktur som kallas oxazolon, öppning av
oxazolonringen och bildandet av en ny ringstruktur, en typ av imidazolon, genom en så kallad dehydrativ
cyklisering. Samtliga steg utfördes i lösning och målet för varje steg var att erhålla ett så högt utbyte
som möjligt genom att förändra och variera tidigare framtagna reaktionsbetingelser. Trots stora förluster
och därmed låga utbyten så resulterade syntesvägen i fem av åtta målmolekyler. Resultaten tyder på att
metoden har stor möjlighet att kunna användas för syntes av peptider där fluoroforen är omgiven av
både den enklaste aminosyran glycin och bestående av mer komplexa aminosyror. Modellmolekylerna
som framställdes utvärderades för sin förmåga att absorbera och emittera ljus i olika lösningsmedel.
Resultaten varierade beroende på lösningsmedlets polaritet, vätebindingsförmåga samt
modellmolekylens struktur, där bättre fotofysikaliska egenskaper kunde påvisas i mer polära
lösningsmedel. De erhållna resultaten antyder på potential hos denna nya typ av fluorescerande
märkning av peptider, och kan därmed tänkas bredda vår förståelse kring peptiders funktion och roll i
såväl den friska som den sjuka människan.

• author: Forsberg, Felix and Knutsson, Frida
• supervisor: Johan Wennerberg
• organization: Centre for Analysis and Synthesis
• course: KASM05 20222
• year: 2023
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Technology and Engineering
• keywords: Organic Chemistry, Organic Synthesis, Fluorescence Spectroscopy, Fluorescent Probe, Green Fluorescent Protein, Peptide, Peptide Labeling, Engineering, Biotechnology
• language: English
• id: 9106673
• date added to LUP: 2023-01-19 11:51:36
• date last changed: 2023-01-19 11:51:36