Cytochrome oxidase biogenesis: Role of the assembly factors CtaK and CtaM in Bacillus subtilis

Popular Abstract (Swedish)

Gensax löser gåta om cellandning

Gensaxen CRISPR-Cas9 är ett användbart redskap för att studera proteiner och deras funktioner. Den tillåter modifikationer att göras på specifika positioner på DNA som kan resultera i olika varianter av proteiner. Dessa varianter kan studeras och slutsatser kan dras om deras funktioner. Här utvärderas en CRISPR-Cas9-baserad metod, samt används för att studera sammansättningen av respiratoriska protein i bakterien Bacillus subtilis.

Elektrontransportkedjan består av flera respiratoriska proteinkomplex som är viktiga för upprätthållandet av en protongradient över cellmembran hos bakterier och mitokondrier. Dessa komplex är uppbyggda av flera komponenter som noga måste sättas ihop så att allt fungerar. Två av dessa komplex är cytokrom caa3 och cytokrom aa3 som finns i bakterien B. subtilis. När bakterien ”andas” syre så kan dess komplex omvandla syre och väte till vatten, som på liknande sätt sker i mitokondrien hos människor. Precis som andra proteinkomplex kräver även dessa en sammansättning och till sin hjälp finns det andra aktörer som har i uppgift att bygga och pussla ihop dem. Proteinerna CtaK och CtaM är två ”hjälpar”-protein som har i uppgift att sätta samman proteinkomplex och det är de som ligger i fokus i den här studien. Målet var att studera CtaK och CtaM vilket gjordes genom att skapa mutanter och varianter av proteinerna och testa effekterna som efterföljer. Varianterna skapades med en CRISPR-Cas9-baserad metod. Proteinet Cas9 är en genetisk ”sax” som kan klippa DNA på specifika ställen och gör att gener kan manipuleras med hög noggrannhet. Metoden undersöktes och applicerades till att användas för att modifiera proteinerna CtaK och CtaM.

Metoden som utvärderades har några komponenter och kan förklaras med fyra steg. Först behövs mutanter av bakterien där generna ctaK respektive ctaM är utbytta mot en gen för antibiotikaresistens, och att gensaxen är guidad till att klippa den antibiotikaresistensgenen, detta tillåter att en modifierad gen av ctaK eller ctaM kan sättas in i stället. Sen behövs ett sätt att få in Cas9 i bakterien och att den uttrycks, detta görs med ett cirkulärt DNA (plasmid) som har genen för Cas9 och sitt guidesystem. Sist behövs de muterade generna. Första steget är att föra in plasmiden samt en muterad gen i bakterien. Det andra steget är att döda alla bakterier med ett annat antibiotikum vars resistens finns på plasmiden, så att bara de finns kvar. Tredje steget är att bli av med plasmiden, efter den har gjort sitt jobb. Fjärde och sista steget är att kolla så den muterade genen finns på plats. Sen kan mutanterna bli testade.

Den första plasmiden funkade inte och alla försöka att hitta varför gav inga svar, men en trolig anledning är att genen för Cas9 var trasig. Tre nya plasmider gjordes som användes i stället, som visade sig fungera. Med de nya plasmiderna så skapades tre olika mutanter av ctaK men inga önskade mutanter av ctaM skapades. Mutanterna av ctaK testades på två olika sätt och alla resultaten visade att cytokrom caa3 hade en lägre enzymaktivitet än vildtypen. När mutanterna av ctaM skulle skapas så verkade det som en region av DNA hade försvunnit genen, som en konsekvens av metoden som används.

Slutsatsen är att CRISPR-Cas9-metoden har några problem som kan påverka dess effektivitet och att dessa problem måste tas om hand om innan metoden kan användas. Den andra slutsatsen är i och med att mutanterna av ctaK hade lägre aktivitet än vildtypen, har proteinet CtaK en viktig roll vid sammansättningen av cytokrom caa3.

Masterexamensprojekt i Molekylärbiologi 60 hp 2022
Biologiska institutionen, Lunds universitet

Handledare: Claes von Wachenfeldt
Biologiska institutionen, Molekylär cellbiologi

• author: Andrén, Martin
• supervisor: Claes von Wachenfeldt
• organization: Degree Projects in Molecular Biology
• course: MOBN03 20212
• year: 2022
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Biology and Life Sciences
• language: English
• id: 9113565
• date added to LUP: 2023-04-18 11:19:46
• date last changed: 2023-04-18 11:19:46