On the Path of Finding a Totally Defined Humanised Medium to Study Immune Cells in a 3D Tumour Model In Vitro
(2022) MOBN03 20212Degree Projects in Molecular Biology
- Abstract
- The use of cancer cell cultures, including immune cells, is essential in cancer research for developing immunotherapies in pre-clinical investigations. However, so far, a large number of animal-derived products are utilised in cell culturing, where experimental variations and reproducibility problems have been reported. Most studies have also only investigated the differentiation of monocytes into moDCs, excluding the subsequent activation of autologous CD4+ T cells by the generated moDCs. This project aimed to investigate the ability of monocytes, isolated from human leukocyte concentrates, to differentiate into moDCs in various animal product-free cell culture media, surveyed by measuring the expression of the cell surface markers CD14... (More)
- The use of cancer cell cultures, including immune cells, is essential in cancer research for developing immunotherapies in pre-clinical investigations. However, so far, a large number of animal-derived products are utilised in cell culturing, where experimental variations and reproducibility problems have been reported. Most studies have also only investigated the differentiation of monocytes into moDCs, excluding the subsequent activation of autologous CD4+ T cells by the generated moDCs. This project aimed to investigate the ability of monocytes, isolated from human leukocyte concentrates, to differentiate into moDCs in various animal product-free cell culture media, surveyed by measuring the expression of the cell surface markers CD14 and CD1a using flow cytometry. The moDCs were then examined for maturation in animal product-free co-cultures with intact cancer cells or cancer cell homogenate, evaluated by measuring CD86 expression in the moDCs. The matured moDCs were studied if they could activate autologous CD4+ T cells by stimulating T cell proliferation in animal product-free 2D and 3D co-cultures under various culture conditions. This was investigated by measuring the mean fluorescence of dividing T cells, the number of cell divisions, and the percentage of non-dividing T cells using flow cytometry. No significant differences in CD14 and CD1a expression in moDCs were reported between the different culture media. There was also no significant difference in CD86 expression in moDCs co-cultured with intact cancer cells or cancer cell homogenate. However, T cell proliferation was significantly increased in co-cultures with cancer cell homogenate than with intact cancer cells in both 2D and 3D, and the presence of moDCs enhanced this further. Performed ELISA showed increased IFN-γ levels under such conditions. Yet, all the experiments need to be repeated before this 3D tumour model in vitro can be evaluated as an alternative study system for cancer immunotherapy. (Less)
- Popular Abstract (Swedish)
- Ett alternativ för att studera immunceller i cellkulturer utan djurprodukter
Cancer är ett samlingsnamn för en rad olika sjukdomar som kan uppstå var som helst i människokroppen. Tillståndet kännetecknas av att tumörer bildas i en viss kroppsdel som kan spridas till andra delar. Tumörer är komplexa strukturer som inte bara innehåller cancerceller. Cancercellerna i en tumör omringas av en så-kallad tumörmikromiljö (TME) som innefattar flera andra celltyper och komponenter, varav immunceller är bland dessa.
Immunceller i TME har fångat stor uppmärksamhet på grund av deras förmågor att både främja och hämma tumörtillväxt. Ett antal cancerterapier har utvecklas som är riktade mot immunsystemet för att öka effektiviteten i behandlingen.... (More) - Ett alternativ för att studera immunceller i cellkulturer utan djurprodukter
Cancer är ett samlingsnamn för en rad olika sjukdomar som kan uppstå var som helst i människokroppen. Tillståndet kännetecknas av att tumörer bildas i en viss kroppsdel som kan spridas till andra delar. Tumörer är komplexa strukturer som inte bara innehåller cancerceller. Cancercellerna i en tumör omringas av en så-kallad tumörmikromiljö (TME) som innefattar flera andra celltyper och komponenter, varav immunceller är bland dessa.
Immunceller i TME har fångat stor uppmärksamhet på grund av deras förmågor att både främja och hämma tumörtillväxt. Ett antal cancerterapier har utvecklas som är riktade mot immunsystemet för att öka effektiviteten i behandlingen. De fyra typer av immunceller som anses vara de som främst hämmar tillväxten och utvecklingen av cancer är dendritiska celler (DC), CD4+ och CD8+ T-celler samt NK celler. De flesta studier på immunceller har gjorts med DC och CD4+ T-celler. Däremot har dessa studier använt fetalt kalvserum (FBS) i mediet som används för att odla cellerna i, vilket är en produkt med både vetenskapliga och etiska nackdelar. Dessa studier har enbart undersökt differentieringen av monocyter till monocyt-deriverade DC (moDC) och inte den påföljande aktiveringen av autologa CD4+ T-celler av de genererade moDC.
Syftet med denna studie var att undersöka förmågan hos monocyter, som har isolerats från humana leukocytkoncentrat, att differentiera till moDC i olika djurproduktfria cellodlingmedier. Detta undersöktes genom att mäta deras uttryck av cellytmarkörerna CD14 och CD1a med flödescytometri. De genererade moDC undersöktes sedan för deras mognad i djurproduktfria co-kulturer med intakta cancerceller eller cancercell-homogenat genom att mäta deras uttryck av CD86. Slutligen undersöktes om de mogna moDC kunde aktivera autologa CD4+ T-celler genom att stimulera T-cellproliferation i djurproduktfria 2D och 3D co-kulturer under olika kulturförhållanden.
Totalt testades nio olika cellodlingmedier, varav åtta var djurproduktfria. Resultaten visade att det inte fanns någon signifikant skillnad i CD14-uttryck i moDC som kultiverades i de nio medierna. Däremot ökade CD1a-uttrycket signifikant i moDC som kultiverades i ett kontrollmedium med 10 % FBS, men även i moDC som kultiverades i två djurproduktfria medier. Uttrycket av CD86 ökade signifikant i moDC som stimulerades med den positiva kontrollen LPS, medan CD86-uttrycket inte ökade signifikant i moDC som kultiverades med intakta cancerceller eller cancercell-homogenat. Däremot var det en signifikant ökning i T-cell proliferation i både 2D och 3D co-kulturer med cancercell-homogenat än med intakta cancerceller där tillsatsen av moDC ökade T-cellproliferationen ytterligare. Resultaten tyder på att cancercellerna utsöndrar substanser som hämmar T-cellerna. En ELISA genomfördes som visade ökade nivåer av interferon-gamma (IFN-γ) i co-kultur med cancercell-homogenat jämfört med intakta cancerceller. IFN-γ har anti-tumöreffekter och bildas av CD4+ T-celler som har differentierats till Typ 1-hjälpar-T-celler.
Sammanfattningsvis visar resultaten att vi är på god väg att hitta ett helt djurproduktsfritt medium för att studera immunceller i TME in vitro. Betydande variationer uppstod vid användning av de djurproduktfria medierna förutom ett som visade lovande resultat. Alla experiment som genomfördes i denna studie behöver därför upprepas med det mediet. Med detta i åtanke kan ett djurproduktsfritt experimentellt system för studium av cancerimmunterapi in vitro utvecklas och användas som är vetenskapligt mer mänskligt jämfört med när produkter från djur används. Detta skulle sedan kunna leda till ett ytterligare steg in i en forskningsvärld där djur inte längre behövs.
Masterexamensprojekt i Molekylärbiologi 60 hp 2022
Biologiska institutionen, Lunds universitet
Handledare: Prof. Stina Oredsson
Funktionell Zoologi/Zoofysiologi, Biologiska institutionen, Lunds universitet (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
http://lup.lub.lu.se/student-papers/record/9113653
- author
- Zhu, Johan
- supervisor
- organization
- course
- MOBN03 20212
- year
- 2022
- type
- H2 - Master's Degree (Two Years)
- subject
- language
- English
- id
- 9113653
- date added to LUP
- 2023-04-20 14:26:04
- date last changed
- 2023-04-20 14:26:04
@misc{9113653,
abstract = {{The use of cancer cell cultures, including immune cells, is essential in cancer research for developing immunotherapies in pre-clinical investigations. However, so far, a large number of animal-derived products are utilised in cell culturing, where experimental variations and reproducibility problems have been reported. Most studies have also only investigated the differentiation of monocytes into moDCs, excluding the subsequent activation of autologous CD4+ T cells by the generated moDCs. This project aimed to investigate the ability of monocytes, isolated from human leukocyte concentrates, to differentiate into moDCs in various animal product-free cell culture media, surveyed by measuring the expression of the cell surface markers CD14 and CD1a using flow cytometry. The moDCs were then examined for maturation in animal product-free co-cultures with intact cancer cells or cancer cell homogenate, evaluated by measuring CD86 expression in the moDCs. The matured moDCs were studied if they could activate autologous CD4+ T cells by stimulating T cell proliferation in animal product-free 2D and 3D co-cultures under various culture conditions. This was investigated by measuring the mean fluorescence of dividing T cells, the number of cell divisions, and the percentage of non-dividing T cells using flow cytometry. No significant differences in CD14 and CD1a expression in moDCs were reported between the different culture media. There was also no significant difference in CD86 expression in moDCs co-cultured with intact cancer cells or cancer cell homogenate. However, T cell proliferation was significantly increased in co-cultures with cancer cell homogenate than with intact cancer cells in both 2D and 3D, and the presence of moDCs enhanced this further. Performed ELISA showed increased IFN-γ levels under such conditions. Yet, all the experiments need to be repeated before this 3D tumour model in vitro can be evaluated as an alternative study system for cancer immunotherapy.}},
author = {{Zhu, Johan}},
language = {{eng}},
note = {{Student Paper}},
title = {{On the Path of Finding a Totally Defined Humanised Medium to Study Immune Cells in a 3D Tumour Model In Vitro}},
year = {{2022}},
}