Skip to main content

LUP Student Papers

LUND UNIVERSITY LIBRARIES

Recombinant expression and purification of sugar beet Phytoglobins in Escherichia Coli BL21 (DE3) including metabolic engineering of the heme biosynthesis

Lindblom, Pennie LU and Geel, Olivia LU (2023) KBKM05 20231
Pure and Applied Biochemistry
Computational Chemistry
Abstract
The protein hemoglobin (Hb) is vital for us humans to ensure enough oxygen replacement in the body. Hb-resembling proteins also exist in plants, these are called phytoglobins (Pgbs). Pgbs are very interesting since they can play a considerable role in the development of blood substitutes and iron supplements for human use. A few years ago, genes that code for Pgb in sugar beet were found and identified. In this thesis, one of these genes, BvPgb1.2, was analyzed further. This was done by bacterial cultivations of E. coli BL21 (DE3) that recombinantly produced the sugar beet Pgb BvPgb1.2. Several cultivations were performed, one with native E. coli cells, one with E. coli cells with wildtype BvPgb1.2 gene (rWt) and three different mutations... (More)
The protein hemoglobin (Hb) is vital for us humans to ensure enough oxygen replacement in the body. Hb-resembling proteins also exist in plants, these are called phytoglobins (Pgbs). Pgbs are very interesting since they can play a considerable role in the development of blood substitutes and iron supplements for human use. A few years ago, genes that code for Pgb in sugar beet were found and identified. In this thesis, one of these genes, BvPgb1.2, was analyzed further. This was done by bacterial cultivations of E. coli BL21 (DE3) that recombinantly produced the sugar beet Pgb BvPgb1.2. Several cultivations were performed, one with native E. coli cells, one with E. coli cells with wildtype BvPgb1.2 gene (rWt) and three different mutations of this gene (K34C, N7C and E120C). It could be concluded that the rWt and the mutants showed a 1000-folds upregulation of the BvPgb1.2 gene in comparison to the native cells seen in the qPCR measurements. However, when investigating the hemH gene, the expression did not vary significantly between the cultivations. HemH is a key gene in heme biosynthesis. During a δ-ALA gradient experiment, an optimal addition of 1M δ-ALA was found to be 138 μl to a 150 ml cultivation flask since the hemH expression was the highest for this addition. Based on the results found in the SDS-PAGE, the QFF purification can be deemed successful. This indicates a thorough removal of other proteins and a fairly pure Pgb sample was received. Gene knockout of the yfex gene, coding for an enzyme that degrades heme, with CRISPR-Cas9 was planned but not finalized. This was due to obstacles during the experiments. A troubleshooting procedure showed that the likely error source was the ligation between the crRNA and the pCRISPR plasmid. All together, it has been shown that rWt and the mutant Pgbs can successfully be produced and purified. However, more trials are needed to ensure reliable results. (Less)
Popular Abstract (Swedish)
Kan hemoglobin från växter lösa humana problem?

Dagligen tar vi för givet att vårt blod syresätts tillräckligt för att orka med alla sysslor. Detta möjliggörs av det livsviktiga proteinet hemoglobin som finns i vårt blod. I dagens samhälle råder det dock blodbrist samtidigt som många drabbas av järnbrist. Det är där forskningen på växthemoglobin kommer in i bilden. Experimenten som genomförts i denna rapport har gått ut på att producera hemoglobin från sockerbeta i bakterier och sedan rena upp det. Resultaten är goda och indikerar att det är möjligt att producera denna typ av hemoglobin i bakterier.

Hemoglobin finns i blodet hos nästan alla ryggradsdjur och har i uppgift att syresätta cellerna så att kroppen kan få energi till alla... (More)
Kan hemoglobin från växter lösa humana problem?

Dagligen tar vi för givet att vårt blod syresätts tillräckligt för att orka med alla sysslor. Detta möjliggörs av det livsviktiga proteinet hemoglobin som finns i vårt blod. I dagens samhälle råder det dock blodbrist samtidigt som många drabbas av järnbrist. Det är där forskningen på växthemoglobin kommer in i bilden. Experimenten som genomförts i denna rapport har gått ut på att producera hemoglobin från sockerbeta i bakterier och sedan rena upp det. Resultaten är goda och indikerar att det är möjligt att producera denna typ av hemoglobin i bakterier.

Hemoglobin finns i blodet hos nästan alla ryggradsdjur och har i uppgift att syresätta cellerna så att kroppen kan få energi till alla kroppsliga processer, såsom ämnesomsättningen och muskelfunktioner. Proteinet har också i uppgift att föra ut koldioxid ur kroppen. Det är de röda blodkropparna som bär på hemoglobinet och proteinet ger blodkropparna deras röda färg. Det finns däremot flera problem i samhället som lägger grunden för forskning kring hemoglobin.

Inom sjukvården är det livsviktigt att det finns tillräckligt med blod för att kunna genomföra transfusioner och därmed rädda människors liv. Men eftersom bloddonatorerna är för få i dagens läge så är det brist på blod. Detta är ett aktuellt problem som skriker efter en lösning. Ett annat vanligt blodrelaterat problem i samhället är järnbrist. Det kan exempelvis drabba personer med vegetarisk kost. Det brukar inte innebära alltför allvarliga konsekvenser, men ibland kan järnbrist leda till anemi. Detta innebär att blodet har för få röda blodkroppar vilket gör att cellerna inte får tillräckligt med syre. På grund av dessa utmaningar är studier på blodsubstitut och järntillskott ett aktuellt ämne inom forskarvärlden.

Något man har kommit fram till på senare tid är att växter, precis som människor, också har hemoglobin. En lösning på blodbristen i samhället kan därför vara artificiellt blod tillverkat av växthemoglobin. Dessa hemoglobiner från växter skulle även kunna ligga till grund för järntillskott som kan användas i vegetarisk mat.

Projektet i denna rapport baseras på att med hjälp av genteknik producera hemoglobin från sockerbetor i en annan värd, så kallad rekombinant produktion. I detta projektet används E. coli som värd för att det är en billig bakterie vars produktion av protein kan skalas upp till större volymer. Vi odlade upp E. coli, som innehåller en gen för hemoglobinet, i små flaskor. Därefter skördade vi cellerna och sedan renade vi upp proteinet. Det vi kom fram till är att denna rekombinanta produktion av hemoglobin i E. coli lyckades och likaså uppreningen av proteinet. Vi såg också att uttrycket av genen som kodar för hemoglobinet ökade mycket jämfört med naiva E. coli. Gener är en mall för proteiner, uttrycks genen mycket så produceras mycket protein. Detta är en bra grund att jobba vidare på i kommande studier för att förhoppningsvis komma ett steg närmare artificiellt blod och järntillskott från växter. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
Lindblom, Pennie LU and Geel, Olivia LU
supervisor
organization
course
KBKM05 20231
year
type
H2 - Master's Degree (Two Years)
subject
keywords
Phytoglobin, Heme, δ-ALA, qPCR, SDS-PAGE, Bacterial cultivation, Escherichia coli, BvPgb1.2, ÄKTA, Applied biochemistry
language
English
id
9123822
date added to LUP
2023-06-15 09:35:37
date last changed
2023-06-15 09:35:37
@misc{9123822,
  abstract     = {{The protein hemoglobin (Hb) is vital for us humans to ensure enough oxygen replacement in the body. Hb-resembling proteins also exist in plants, these are called phytoglobins (Pgbs). Pgbs are very interesting since they can play a considerable role in the development of blood substitutes and iron supplements for human use. A few years ago, genes that code for Pgb in sugar beet were found and identified. In this thesis, one of these genes, BvPgb1.2, was analyzed further. This was done by bacterial cultivations of E. coli BL21 (DE3) that recombinantly produced the sugar beet Pgb BvPgb1.2. Several cultivations were performed, one with native E. coli cells, one with E. coli cells with wildtype BvPgb1.2 gene (rWt) and three different mutations of this gene (K34C, N7C and E120C). It could be concluded that the rWt and the mutants showed a 1000-folds upregulation of the BvPgb1.2 gene in comparison to the native cells seen in the qPCR measurements. However, when investigating the hemH gene, the expression did not vary significantly between the cultivations. HemH is a key gene in heme biosynthesis. During a δ-ALA gradient experiment, an optimal addition of 1M δ-ALA was found to be 138 μl to a 150 ml cultivation flask since the hemH expression was the highest for this addition. Based on the results found in the SDS-PAGE, the QFF purification can be deemed successful. This indicates a thorough removal of other proteins and a fairly pure Pgb sample was received. Gene knockout of the yfex gene, coding for an enzyme that degrades heme, with CRISPR-Cas9 was planned but not finalized. This was due to obstacles during the experiments. A troubleshooting procedure showed that the likely error source was the ligation between the crRNA and the pCRISPR plasmid. All together, it has been shown that rWt and the mutant Pgbs can successfully be produced and purified. However, more trials are needed to ensure reliable results.}},
  author       = {{Lindblom, Pennie and Geel, Olivia}},
  language     = {{eng}},
  note         = {{Student Paper}},
  title        = {{Recombinant expression and purification of sugar beet Phytoglobins in Escherichia Coli BL21 (DE3) including metabolic engineering of the heme biosynthesis}},
  year         = {{2023}},
}