Early gene expression of Beta vulgaris in protoplast regeneration

Abstract

Sugar beet (Beta vulgaris) is a high value crop, grown mostly in temperate climate and is the source of 30% of the world’s sugar production. There is a high economic incentive to breed for better yielding crops, e.g genetic resistance against diseases. To investigate the effect of new genes in cultivar lines, genetically modified organisms (GMO) can be used but not commercially sold, according to EU regulations. One of the tools in GMO is protoplast regeneration, regenerating a whole plant from a single transformed plant cell. Protoplast regeneration has so far been unsuccessful in Beta vulgaris.

The aim of this project was to utilize Sanger sequencing, RT-qPCR and microscopy studies to try and elucidate the microcalli formation from protoplasts. We evaluated the usage of 4 genes to serve as indicators of the physiological state and developmental stage the protoplasts were in as a response to phytohormone and other compounds.

Some genes were shown to have a high variability in the exon sequence, while other genes were identical compared to published reference genomes of B. vulgaris. It was concluded that no gene or gene signature could be identified via RT-qPCR that had the potential to predict future morphological changes of protoplasts. Even though the genes could not be used as predictive elements, the project was a partial success as a media composition was identified that showed early morphological changes from protoplast to microcalli during multiple replicates. Morphological changes were observed in response to phytohormone and antioxidant treatments. The protoplasts developed over a period of 10 days and clearly showed signs of microcalli formations in two distinct genotypes of Beta vulgaris. Future studies are required to elucidate the regeneration of protoplast into complete individuals.

Popular Abstract (Swedish)

Från en cell till hel individ, protoplast regenerering.

Växtförädling för att öka avkastningen av grödor har skett under lång tid. Numera används molekylära metoder för att påskynda processen av selektionen av gynnsamma egenskaper, så som resistans mot sjukdomar eller ohyra. Geneditering kan användas för att validera nya gener i tidigare framgångsrika kultivarer och möjligheten att regenerera en hel växt från en enskild genediterad cell har potentialen att påskynda förädlingsprocessen markant.

För att klarlägga en metod att regenerera en frisk individ av Beta vulgaris (sockerbeta) från en enda cellväggsfri cell (protoplast) tagen från ett blad användes flera metoder. Först valdes flera gener på grund av deras inblandning i utvecklings eller fysiologiska processer. Dessa gener blev sekvenserade genom Sanger-dideoxy-metoden på grund av det variabla genomet av B. vulgaris för att pålitligt kunna mäta genexpression vid senare skede. Utifrån de erhållna sekvenserna kunde primers designas, korta enkelsträngade nukleinsyror som är komplementära till gensekvensen av intresse. Primers var nödvändiga för att studera genuttryck genom reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) av protoplaster och andra vävnader som blivit utsatta för olika behandlingar av fytohormon och substanser. Genuttrycken kunde sedan jämföras mellan olika vävnader av växtmaterial som befanns i fysiologiskt eller utvecklingsmässigt olika tillstånd i hopp om att finna ett liknande mönster av genuttryck. Mikroskopistudier nyttjades för att studera morfologiska förändringar för att kunna korrelera till en relativ ökning eller minskning av genexpression från utvalda gener.

Målet var sedan att identifiera en gen eller genuttrycksmönster som kunde agera som indikator av att protoplasterna utvecklades mot mer differentierad eller odifferentierad vävnad.

Slutsatsen av experimenten var att sekvensen av vissa gener hade en hög variabilitet medan andra gener var identiska till sedan tidigare publicerade genom av B. vulgaris. Ingen gen eller gensignatur kunde identifieras för att förutspå framtida morfologiska förändring. En lyckad aspekt var att en mediakomposition kunde karaktäriseras som gav morfologiska förändring av protoplasterna och inducerade kallusformering. Protoplaster från två distinkt olika genotyper av B. vulagris lät utvecklas under 10 dagar och visade tydliga morfologiska förändring men framtida studier behövs för att klarlägga en konkret metod för att regenerera protoplaster till en hel individ.

Masterexamensprojekt i Molekylärbiologi, 45 hp 2023.
Biologiska institutionen, Lunds universitet.

Handledare:
Johannes Stratmann, R&D, DLF BeetSeed AB.
Allan Rasmusson, Molekylär cellbiologi, Lunds universitet.

• author: Silwer, Simon
• supervisor: Johannes Stratmann
• organization: Degree Projects in Molecular Biology
• course: MOBN02 20231
• year: 2024
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Biology and Life Sciences
• language: English
• id: 9146717
• date added to LUP: 2024-01-24 14:11:53
• date last changed: 2024-01-24 14:11:53