Optimization of pore geometry, pore density and membrane material for nanoelectroporation

Abstract

Electroporation is a technique used to transfect cells, i.e. to introduce nucleic acids in cells. The method consists in applying a voltage over the cells which leads to the opening of pores in the cell membrane through which cargo can diffuse to the cell interior. If the cells are cultivated on top of nanopores or nanostraws, dielectric structures one can achieve nanoelectroporation when applying an electric field over the substrate. In this process, the nanostraw/nanopore membrane focuses and localizes the electric field inside the pores, which enables the use of a low-voltage electric field that limits the affected area of the cell membrane. This leads to low cell death while retaining a high percentage of transfected cells. However, with this method, the parameters affecting cell viability and transfection efficiency are not fully understood. In this thesis, Nanopore/nanostraw electroporation was performed on clonal beta cells using nanopore/nanostraw membranes with different surface material, pore size and pore density. The aim was to investigate the effect of these different parameters on viability, transfection efficiency and intensity of injected plasmid. Cells cultured on polycarbonate nanopore membranes showed lower percentage of transfection compared to alumina coated membranes, which could be explained by a lower cell adhesion on polycarbonate. Comparing membranes with nanopores and nanostraws, the use of nanostraws led to higher transfection efficiency, due to the better seal between cell and straw and possibly also the effect the high aspect ratio nanostraws has on membrane tension of the cells. The membranes with larger pores and higher porosity gave higher transfection efficiency compared to smaller pores and lower porosity. In the first case because of the stronger localized field inside each large pore, and in the second because of the larger area through which plasmids can be transported. The results indicate that the technique can be an important pillar in both cell and gene therapies as well as in live-cell probing techniques.

Popular Abstract (Swedish)

Injektion av specifikt utvalt DNA i celler är en teknik som har många användningsområden, tillexempel i cell- och genterapier men också för att studera orsaker till olika sjukdomar som diabetes. Målet med att introducera DNA är att få cellen att bete sig på ett önskat sätt. Anledningen till detta kan vara för att antingen kunna använda cellen som en behandling mot cancer, eller för att åstadkomma andra förändringar, i eller utanför genomet, för att behandla eller undersöka anledningarna till uppkomsten av en viss sjukdom.

DNA kan introduceras i celler på många sätt. Ett av dem innebär att cellerna som flyter runt i en vätska tillsammans med DNAt utsätts för ett elektriskt fält vilket får små hål att öppna upp sig i cellmembranet, så att cellen liknar en innebandyboll. Genom dessa hål kan DNA ta sig in i cellen. En fördel med denna teknik är att många celler kan modifieras samtidigt. En nackdel är att det finns en risk att det elektriska fältet öppnar upp så pass många hål i cellmembranet att cellen dör för att den inte lyckas laga det igen. Man kan välja att odla cellerna på membran med nasnostrukturer i stället för att ha dem fritt flytandes i en vätska. Dessa nanostrukturer, kallade nanoporer eller nanostrån, är lika stora som en tusendels hårstrå och är väldigt små hål genom membranet eller små sugrörsliknande strukturer som sticker upp ur membranet. Nanostrukturerna kan begränsa det elektiska fältets skadlighet för cellen genom att se till att fältet bara påverkar väldigt små delar av cellmembranet.

I mitt projekt introducerade vi DNA i celler som odlades på sådana membran med olika material, olika former av nanostrukturer och olika grader av hålighet. Efter det jämförde vi andel överlevande celler, andel celler med DNA samt mängden DNA i dessa celler beroende på vilken typ av membran de hade odlats på. Membranen var gjorda av en sorts plast och hade antingen nanoporer eller nanostrån. Nanoporerna täcktes med ett tunt lager metall för att få membran med olika ytskikt medan nanostråna tillverkades med hjälp av metallen.

Resultaten visade att alla parametrar hade påverkan på antalet överlevande celler, antalet celler som hade fått DNA levererat och mängden DNA i cellerna. Först visade det sig att valet av material var viktigt eftersom det påverkade cellernas förmåga att fastna på membranet, vilket i sin tur påverkar hur stor andel av cellerna som fick DNA introducerat. Metallytan var betydligt bättre än plasten. Vi såg också att större andel av cellerna som odlades på ett membran med de sugrörsliknande stråna blev injicerade med DNA i jämförelse med celler som odlades på membran med porer. Detta troddes bero på att cellerna kunde interagera på ett mer gynnsamt sätt med de uppstickande stråna så att hålen som det elektiska fältet öppnade upp i cellmembranet kunde bli både större och stabilare.

När vi jämförde membran med olika grad av hålighet kunde vi tydligt se att det var bra att ha mer än en por eller strå i snitt per cell eftersom många celler annars blev helt utan DNA. Det visade sig också att de var enklare för DNA molekylerna att ta sig in i cellerna om diametern hos porerna eller stråna var större. En nackdel med en lite större diameter visade sig dock vara att det var lite svårare för cellen att laga de större hålen i sitt membran efter att det elektriska fältet har stängts av, vilket innebar att en lite större andel av cellerna dog.

Från resultaten kunde vi dra slutsatsen att även om metoden behöver anpassas beroende på cellsort och vilken typ av DNA som ska levereras, så visar den prov på att kunna bli ett väldigt viktigt verktyg i jakten på nya behandlingsmetoder och läkemedel mot många allvarliga och svårbehandlade sjukdomar. Metoden med nanostrån erbjuder potential för framtida innovationer inom medicinsk forskning och terapeutisk utveckling.

• author: Davidsson Bencker, Sara
• supervisor: Christelle Prinz; Frida Ekstrand
• organization: Solid State Physics; Department of Physics; Faculty of Engineering, LTH
• course: PHYM01 20232
• year: 2024
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Physics and Astronomy
• keywords: Electroporation, nanoelectroporation, nanopores, nanostraws
• language: English
• id: 9148931
• date added to LUP: 2024-02-26 07:49:30
• date last changed: 2024-02-26 07:49:30