Skip to main content

LUP Student Papers

LUND UNIVERSITY LIBRARIES

Heterologous expression, purification, natural abundance 2D NMR assignment and in silico amyloid propensity prediction of the brain natriuretic peptide hormone

Hichri, Elias LU (2024) KFKM05 20232
Biophysical Chemistry
Abstract
Natriuretic peptides (NPs), such as atrial natriuretic peptide (ANP) and brain natriuretic peptide (BNP), are hormones produced in the heart’s cardiomyocytes. ANP has been shown to form amyloids, which prevent the heart from functioning properly, ultimately increasing the risk of congestive heart failure (CHF). BNP also has been found in amyloid structures within the heart. Here, multiple algorithms have been used to predict which sequences within BNP and its precursors that are amyloidogenic. A laboratory protocol was established to obtain a pure sample of BNP, where it was heterologously expressed as the fusion protein his6-EDDIE-BNP in BL21(DE3)pLysS E. coli, forming inclusion bodies (IBs). These were obtained through sonication cell... (More)
Natriuretic peptides (NPs), such as atrial natriuretic peptide (ANP) and brain natriuretic peptide (BNP), are hormones produced in the heart’s cardiomyocytes. ANP has been shown to form amyloids, which prevent the heart from functioning properly, ultimately increasing the risk of congestive heart failure (CHF). BNP also has been found in amyloid structures within the heart. Here, multiple algorithms have been used to predict which sequences within BNP and its precursors that are amyloidogenic. A laboratory protocol was established to obtain a pure sample of BNP, where it was heterologously expressed as the fusion protein his6-EDDIE-BNP in BL21(DE3)pLysS E. coli, forming inclusion bodies (IBs). These were obtained through sonication cell lysis, where the IBs were dissolved in a urea solution. BNP was obtained through autoproteolysis, then purified through reverse-phase HPLC and lyophilization. NMR assignments of BNP resonances were performed via natural abundance of 15N and 13C through 1H-1H TOCSY, 1H-1H NOESY, 13C HSQC-TOCSY, 13C HMBC, 15N HSQC and 15N HSQC-TOCSY experiments. The chemical shifts for BNP were used to calculate secondary chemical shifts for C=O, CA, CB, N, HN and HA relative to random coil chemical shifts. The secondary chemical shift analyses showed that BNP is unstructured in solution. (Less)
Popular Abstract (Swedish)
Livet kan ibland tolkas som ett svårt pysselspel; det är många bitar som måste tas till hänsyn och läggas på rätt plats för att kunna få ihop en klar och korrekt bild på det hela. På den biologiska och samtidigt mikroskopiska skalan gäller detsamma för protein och peptider (ett kortare protein) som är ganska viktiga pysselbitar som ansvarar för de flesta funktioner i kroppen. Här behöver man inte lägga ihop bitarna själv som tur nog då det sker automatiskt! Men såklart är kroppen inte felfri och kan lägga de här biologiska pysselbitarna på fel ställen, vilket kan orsaka allvarliga problem kortsiktigt och långsiktigt. Till skillnad från ett vanligt pyssel så är det mycket svårare för kroppen att inse att den behöver flytta på bitarna, eller... (More)
Livet kan ibland tolkas som ett svårt pysselspel; det är många bitar som måste tas till hänsyn och läggas på rätt plats för att kunna få ihop en klar och korrekt bild på det hela. På den biologiska och samtidigt mikroskopiska skalan gäller detsamma för protein och peptider (ett kortare protein) som är ganska viktiga pysselbitar som ansvarar för de flesta funktioner i kroppen. Här behöver man inte lägga ihop bitarna själv som tur nog då det sker automatiskt! Men såklart är kroppen inte felfri och kan lägga de här biologiska pysselbitarna på fel ställen, vilket kan orsaka allvarliga problem kortsiktigt och långsiktigt. Till skillnad från ett vanligt pyssel så är det mycket svårare för kroppen att inse att den behöver flytta på bitarna, eller så sitter de alldeles för hårt på varandra. Ett av dessa problem är amyloider, vilket mer formellt sagt är ansamlingar av protein eller peptider.

Peptiden BNP (brain natriuretic peptide) var i fokus, som trots dess namn faktiskt produceras i hjärtat, för att det är misstänkt att den har en betydande roll inom hjärtsvikt. I det här examensarbetet var målet att skapa en pålitlig metod att tillverka större mängder av peptiden som också ska vara ren från andra ämnen. Detta behövs för att kunna undersöka om BNP faktiskt tar delansvar i sjukdomen. Programvara har också använts för att kolla om BNP kunde skapa amyloider.

Här framställdes peptiden genom att använda sig av bakterien E. coli, ett vanligt förekommande bakterie i tjocktarmen, som har fått speciellt DNA tillagt inom dem. Ett problem är att peptider förstörs ganska lätt, så DNA sekvensen är modifierad så att peptiden även är bundet till ett större protein vid tillverkning. Det som skapas kallas för his6-EDDIE-BNP. His6 är en peptid som visade sig vara onödig i just det här projektet, men har nytta inom vissa metoder vid rening av prov. his6-EDDIE-BNP tas sedan ut från bakterierna med hjälp av högt ljud, vilket leder till att luftbubblor imploderar och förstör cellväggarna. Det större proteinet EDDIE har en speciell förmåga att klyva sig själv om den befinner sig i rätt miljö, vilket frigör BNP. Centrifugering användes inom vissa steg i projektet för att separera ämnen med olika molekylvikt, till exempel cellväggar och BNP. HPLC (High-Performance Liquid Chromatography) separerar ämnen beroende på hur snabbt de förflyttar sig och användes för att urskilja BNP från andra protein. Vätska togs bort genom att frystorka BNP. Det rena provet med BNP analyserades sedan genom olika NMR (Nuclear Magnetic Resonance) experiment, vilket utnyttjar kvantmekaniska egenskaper för att kunna “se” strukturen på peptiden. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
Hichri, Elias LU
supervisor
organization
alternative title
Heterolog uttryckning, rening, naturlig förekomst 2D NMR-tilldelning och in silico amyloidbenägenhetsprediktion av hormonet 'brain natriuretic peptide'
course
KFKM05 20232
year
type
H3 - Professional qualifications (4 Years - )
subject
keywords
brain natriuretic peptide, BNP, NMR, assignment, natural abundance, chemical shift, amyloid propensity, EDDIE, biophysical chemistry, autoproteolysis, inclusion bodies, heterologous expression
language
English
additional info
Examiner: Mikael Akke
id
9151059
date added to LUP
2025-01-31 07:41:22
date last changed
2025-01-31 07:41:22
@misc{9151059,
  abstract     = {{Natriuretic peptides (NPs), such as atrial natriuretic peptide (ANP) and brain natriuretic peptide (BNP), are hormones produced in the heart’s cardiomyocytes. ANP has been shown to form amyloids, which prevent the heart from functioning properly, ultimately increasing the risk of congestive heart failure (CHF). BNP also has been found in amyloid structures within the heart. Here, multiple algorithms have been used to predict which sequences within BNP and its precursors that are amyloidogenic. A laboratory protocol was established to obtain a pure sample of BNP, where it was heterologously expressed as the fusion protein his6-EDDIE-BNP in BL21(DE3)pLysS E. coli, forming inclusion bodies (IBs). These were obtained through sonication cell lysis, where the IBs were dissolved in a urea solution. BNP was obtained through autoproteolysis, then purified through reverse-phase HPLC and lyophilization. NMR assignments of BNP resonances were performed via natural abundance of 15N and 13C through 1H-1H TOCSY, 1H-1H NOESY, 13C HSQC-TOCSY, 13C HMBC, 15N HSQC and 15N HSQC-TOCSY experiments. The chemical shifts for BNP were used to calculate secondary chemical shifts for C=O, CA, CB, N, HN and HA relative to random coil chemical shifts. The secondary chemical shift analyses showed that BNP is unstructured in solution.}},
  author       = {{Hichri, Elias}},
  language     = {{eng}},
  note         = {{Student Paper}},
  title        = {{Heterologous expression, purification, natural abundance 2D NMR assignment and in silico amyloid propensity prediction of the brain natriuretic peptide hormone}},
  year         = {{2024}},
}