Identification and characterization of a novel xylosidase capable of removing xyloses from biological drugs

Abstract

When producing biological drugs, homogeneity within and between batches is of great importance to protect public health from sources of variability. Most biopharmaceuticals are proteins, and proteins tend to undergo post-translational modifications, such as glycosylation. As this may impact potency and immunogenicity, accurately controlling and measuring the glycosylation of a biological drug is necessary to ensure its quality. Several studies have shown that an O-xylosylation on the serine residues of GS-linkers might occur when expressing fusion proteins in mammalian cells. Products removing different glycosylation from proteins exist, however, none capable of removing O-linked xyloses from GS-linkers.

To search for an enzyme capable of removing O-linked xyloses, twelve putative xylosidases (Xyl-A – Xyl-L) were investigated. Enzymes were expressed and produced in BL21 (DE3) STAR E. coli, lysed through sonication, and purified using IMAC (Ni2+ column coupled to an FPLC). To simulate an O-xylosylyzed GS-linker, two different substrates were used for activity analysis. 4MU-xylose was used for high throughput initial analysis. For xylosidases active on 4MU-xylose, additional activity studies were conducted using a peptide with a GS sequence and a xylose as this even better simulates a fusion protein.

After analysis on 4MU-xylose, candidates were chosen for second analysis. Xyl-L showed the highest (21%, overnight) removal of xylose from the peptide and was further characterized. Optimum pH, temperature and salt concentration was investigated. Observations of precipitation and protease activity were made, and this was reduced by changing purification method and lowering the incubation temperature. Resulting in a significantly improved hydrolysis (79%) during similar incubation conditions. Providing a promising xylosidase candidate for the removal of xyloses from biological drugs.

Popular Abstract (Swedish)

Vårt nya enzym tar bort oönskade xyloser från proteiner. Detta kan inte bara underlätta analys, utan även förbättra kvaliteten och säkerheten för både nutidens och framtidens biologiska läkemedel.


Föreställ dig en värld utan vaccin, utan immunoterapi, och utan insulin. Detta är en värld utan biologiska läkemedel. Dessa har länge varit en stor del av marknaden för läkemedel, och för att de ska fortsätta att utvecklas är det avgörande att deras kvalitet och säkerhet går att kontrollera.

För att vara säker på att ett läkemedel fungerar som det ska är det viktigt att det inte finns några variationer i läkemedlet. Om det förändras på något sätt är det svårt att veta vad det kommer göra, var i kroppen det kommer hamna, och hur säkert det är. Eftersom biologiska läkemedel produceras i levande celler är det svårt att kontrollera att dessa alltid blir exakt likadana. Till exempel har man märkt att det på vissa biologiska läkemedel, ibland råkar fästa sig sockermolekyler, vilket kan påverka läkemedlen, och försvåra analys av dem.

Därför har vi utvecklat ett enzym som kan ta bort dessa. För att se till så att även framtidens biologiska läkemedel förblir säkra och effektiva har vi hittat ett enzym som man kan använda för att klippa av en speciell sorts sockermolekyl, xylos. Enzymer som tar bort andra sockermolekyler är populära redan idag, men detta är det första som har förmågan att ta bort ensamma xyloser från proteinbaserade läkemedel.

Enzymet som utvecklats heter Xyl-L, och har efter optimering och utveckling lyckats klyva 79% av all xylos från ett substrat som efterliknar ett biologiskt läkemedel. För att uppnå detta har vi behövt testa 12 olika enzymer, testa på två olika substrat, och hitta optimal temperatur, pH och tid för att Xyl-L skulle fungera så bra som möjligt. Till en början kunde enzymet endast ta bort 21% av xylosen, men efter optimering och minskning av oönskade aktiviteter lyckades vi öka aktiviteten tillräckligt för att ta bort 79%. Detta enzym och denna studie är en utmärkt utgångspunkt för att se till att xylos på biologiska läkemedel inte kommer vara ett problem i framtiden.

• author: Martinsson, Anton
• supervisor: Sofia Marmon; Rolf Lood
• organization: Pure and Applied Biochemistry; Computational Chemistry
• alternative title: Utveckling av ett enzym med förmågan att avlägsna xylos från biologiska läkemedel
• course: KBKM05 20241
• year: 2024
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Biology and Life Sciences
• keywords: Xylosidase, glycosylase, O-linked xyloses, O-glycosylation, GS-linker, applied biochemistry
• language: English
• id: 9155352
• date added to LUP: 2024-05-31 14:10:56
• date last changed: 2024-05-31 14:10:56