Skip to main content

LUP Student Papers

LUND UNIVERSITY LIBRARIES

Optimization of a multiplexed immunofluorescent panel for identification of myeloid cell subpopulations and their impact on survival of head and neck squamous cell carcinoma

Vanagas, Robertas LU (2024) KIMM05 20241
Department of Immunotechnology
Abstract
The advent of new technologies for single-cell RNA sequencing analyses has resulted in the discovery that the myeloid compartment in the tumor microenvironment (TME) is far more complex than previously appreciated, and that intrinsic and extrinsic factors in the TME highly influence the immunosuppressive or active states of these cell types. There is now a need to develop multiplex assays to identify the presence, functional properties and location and states of these populations, in larger cohorts of clinical samples, often available as biobanked paraffin-embedded tissue. In this study, we designed and optimized a multiplexed immunofluorescence (mIF) panel for identification and survival analysis of myeloid cell subpopulations in head and... (More)
The advent of new technologies for single-cell RNA sequencing analyses has resulted in the discovery that the myeloid compartment in the tumor microenvironment (TME) is far more complex than previously appreciated, and that intrinsic and extrinsic factors in the TME highly influence the immunosuppressive or active states of these cell types. There is now a need to develop multiplex assays to identify the presence, functional properties and location and states of these populations, in larger cohorts of clinical samples, often available as biobanked paraffin-embedded tissue. In this study, we designed and optimized a multiplexed immunofluorescence (mIF) panel for identification and survival analysis of myeloid cell subpopulations in head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). The Akoya Opal platform was used for mIF microscopy, and the optimization process included determination of optimal antibody dilutions, antigen retrieval conditions and antibody sequence. The optimized mIF panel was subsequently used to stain a cohort of 114 HNSCC paraffin-embedded tissue samples which yielded 101 valid TMA cores for survival analysis. Multivariate Cox regression models concluded that high CD8 expression correlated with better overall survival, while high M2 Macrophage (CD68+CD163+), CCR7+ Macrophages (CD68+CCR7+) and high LAMP3+ expression correlated with worse survival. The CCR7+LAMP3+ cells, believed to represent activated Dendritic cells (DC), did not significantly impact overall survival. Additionally, this study emphasizes the need for robust multivariate survival models as excluding significant patient parameters affects end results for biomarker significance. Furthermore, an outlook into spatial transcriptomic analysis for myeloid subpopulations revealed three C1Qa-macrophage (CD14+CD68+CD163+ITGAX+) populations defined by high expression of either SPP1, APOE or neither. Two activated DC populations (CCR7+LAMP3+CSF2RA+CD83+) were identified with a clear division by CCL22 expression. Future studies may investigate the spatial localizations and interactions of the identified myeloid populations with other lymphocytes and perform functional in vitro assays to identify potentially new therapeutic targets in HNSCC. (Less)
Popular Abstract (Swedish)
Huvud och halscancer (HNC) är den sjunde vanligaste cancerformen globalt och vanliga riskfaktorer inkluderar rökning, alkoholkonsumtion och infektion med humant papillomvirus (HPV). Nyligen har teknologiska framsteg öppnat för möjligheten att mycket djupare utforska och kategorisera människokroppens celler. Detta inkluderar även immunceller och närmare bestämt myeloidceller som är viktiga för att kroppen ska kunna bilda ett immunförsvar mot exempelvis cancer. Genom att studera myeloidceller, ökar förståelsen för hur cancer undviker kroppens immunförsvar och kan öppna för nya mål för framtida behandlingar.

Denna studie har därför använt en avancerad mikroskopieringsmetod (multiplexerad immunfluoroscens, mIF) som tillåter visualisering... (More)
Huvud och halscancer (HNC) är den sjunde vanligaste cancerformen globalt och vanliga riskfaktorer inkluderar rökning, alkoholkonsumtion och infektion med humant papillomvirus (HPV). Nyligen har teknologiska framsteg öppnat för möjligheten att mycket djupare utforska och kategorisera människokroppens celler. Detta inkluderar även immunceller och närmare bestämt myeloidceller som är viktiga för att kroppen ska kunna bilda ett immunförsvar mot exempelvis cancer. Genom att studera myeloidceller, ökar förståelsen för hur cancer undviker kroppens immunförsvar och kan öppna för nya mål för framtida behandlingar.

Denna studie har därför använt en avancerad mikroskopieringsmetod (multiplexerad immunfluoroscens, mIF) som tillåter visualisering av flera biomarkörer i tumörprover. Noggrann optimering av denna panel har möjliggjort studien att detektera och kvantifiera nya typer av myeloidceller i en kohort av 114 HNC tumörer. 101 av dessa prover användes även för en grundlig statistisk överlevnadsanalys. Överlevnadsanalysen inkluderade och kompenserade för signifikanta parametrar som patientens ålder och vid vilket stadie tumören diagnostiserades. Analysen visade att höga nivåer av cytotoxiska (CD8+) T-celler, som allmänt är kända för att angripa cancerceller, var associerat med bättre överlevnad. Däremot var förhöjda nivåer av M2-makrofager (CD68+CD163+), aktiverade makrofager (CD68+CCR7+) och höga nivåer av proteinet LAMP3 associerat med sämre överlevnadschanser. Aktiverade dendritiska celler (CCR7+LAMP3+) visade ingen signifikant påverkan på överlevnad, i kontrast med vad som tidigare beskrivits i litteraturen. Dessa resultat visar på behovet av att använda robusta statistiska modeller som tar hänsyn till patientfaktorer för att säkerställa korrekta slutsatser.

Vidare användes spatial transkriptomik för att vidare utforska och kategorisera myeloidceller i ett tumörprov från HNC. Denna analys av genuttrycksprofiler resulterade i identifiering av 3 makrofagpopulationer och 2 aktiverade dendritcellspopulationer. Analysen visade tydlig skillnad mellan dessa populationer baserat på ett fåtal starkt under- eller överuttryckta gener. Resultaten av den här studien har ökat vår inblick i vilka myeloida populationer som kan infiltrera en HNC tumör men vidare forskning behövs för att förstå hur myeloidcellerna interagerar med andra immun- och cancerceller. Denna djupare förståelse av immuncelldiversitet öppnar upp för framtida forskning, inklusive utforskning av de rumsliga relationerna mellan dessa celler och andra immuncellstyper inom tumörer. Slutligen kan dessa insikter leda till utvecklingen av riktade terapier, vilket förbättrar behandlingseffektiviteten och ökar överlevnadsfrekvenserna för patienter som kämpar mot HNC. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
Vanagas, Robertas LU
supervisor
organization
course
KIMM05 20241
year
type
H2 - Master's Degree (Two Years)
subject
keywords
Immunotechnology, Head and neck, immunofluorescence, survival, cancer, tumor, transcriptomics, multiplexed immunofluorescence, mIF, IF, immunohistochemistry, IHC, HNSCC, immunology
language
English
id
9177206
date added to LUP
2024-10-31 14:32:13
date last changed
2024-10-31 14:32:13
@misc{9177206,
  abstract     = {{The advent of new technologies for single-cell RNA sequencing analyses has resulted in the discovery that the myeloid compartment in the tumor microenvironment (TME) is far more complex than previously appreciated, and that intrinsic and extrinsic factors in the TME highly influence the immunosuppressive or active states of these cell types. There is now a need to develop multiplex assays to identify the presence, functional properties and location and states of these populations, in larger cohorts of clinical samples, often available as biobanked paraffin-embedded tissue. In this study, we designed and optimized a multiplexed immunofluorescence (mIF) panel for identification and survival analysis of myeloid cell subpopulations in head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). The Akoya Opal platform was used for mIF microscopy, and the optimization process included determination of optimal antibody dilutions, antigen retrieval conditions and antibody sequence. The optimized mIF panel was subsequently used to stain a cohort of 114 HNSCC paraffin-embedded tissue samples which yielded 101 valid TMA cores for survival analysis. Multivariate Cox regression models concluded that high CD8 expression correlated with better overall survival, while high M2 Macrophage (CD68+CD163+), CCR7+ Macrophages (CD68+CCR7+) and high LAMP3+ expression correlated with worse survival. The CCR7+LAMP3+ cells, believed to represent activated Dendritic cells (DC), did not significantly impact overall survival. Additionally, this study emphasizes the need for robust multivariate survival models as excluding significant patient parameters affects end results for biomarker significance. Furthermore, an outlook into spatial transcriptomic analysis for myeloid subpopulations revealed three C1Qa-macrophage (CD14+CD68+CD163+ITGAX+) populations defined by high expression of either SPP1, APOE or neither. Two activated DC populations (CCR7+LAMP3+CSF2RA+CD83+) were identified with a clear division by CCL22 expression. Future studies may investigate the spatial localizations and interactions of the identified myeloid populations with other lymphocytes and perform functional in vitro assays to identify potentially new therapeutic targets in HNSCC.}},
  author       = {{Vanagas, Robertas}},
  language     = {{eng}},
  note         = {{Student Paper}},
  title        = {{Optimization of a multiplexed immunofluorescent panel for identification of myeloid cell subpopulations and their impact on survival of head and neck squamous cell carcinoma}},
  year         = {{2024}},
}