Validation of a potential new target for drug development, preventing arthritis development by T-cell regulation

Abstract

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease resulting in swelling and destruction of bone and cartilage within the small joints. The mechanism behind the disease is not fully understood, but the interaction of autoreactive T-cells with effector cells like B-cells and macrophages through cytokine signaling is believed to be important. A potential target for drug development against arthritis that possibly regulates T-cell activity has been identified by Redoxis AB. The aim of this Master degree project was to design a cell culture based method measuring the activity of the target enzyme and to validate it in terms of influence on T-cell cytokines. A spectrophotometric assay measuring the enzymatic activity over time was modified in HepG2 cells. The k-values of the slope, eg. the rate of enzymatic conversion, decreased when adding an inhibitor and inconsistently increased when adding an activator. Spleen cells from dark agouti rats, naive and with pristane induced arthritis, were exposed to the inhibitor and activator and analysed with FACS and ELISA. During FACS analysis it was revealed that the effect of the inhibitor might be due to toxicity. However, the IFN-γ and IL-2 levels were above the levels for unstimulated cells and almost in the range of the activated control cells after inhibitor treatment, contradicting that the cells would be dead. This indicated that target inhibition resulted in less cytokine production from T-cells. Simultaneously, target activation also reduced the IL-2 and IFN-γ levels compared to the control. Further validation would be required to make a proper conclusion.

Abstract (Swedish)

Utvärdering av ett målprotein för behandling av ledgångsreumatism

Reumatisk artrit (RA), eller ledgångsreumatism som det också kallas, är en autoimmun sjukdom som 1% av världens befolkning lider av. Kroppens egna immunceller blir autoreaktiva och attackerar lederna i främst händer och fötter. Den ökade mängden immunceller i de här lederna resulterar i svullnad och inflammation, men även ben och brosk kan påverkas sekundärt och brytas ner. Dock är det oklart varför och hur den här sjukdomen uppstår. Den typiska RA patienten är en kvinna över 60 år, men patienterna skiljer sig åt när det kommer till sjukdomsmanifestation, genetisk bakgrund och hur de svarar på behandling. Idag behandlas ledgångsreumatism främst med olika typer av smärtstillande och med läkemedel som minskar symptomen genom att påverka immuncellernas kommunikation. Då de här läkemedlen har en varierande effekt och en risk för allvarliga biverkningar finns det ett behov av nya behandlingsalternativ.

Redoxis AB har identifierat ett protein vars nivåer i kroppen skulle kunna påverka hur reaktiva T-cellerna är. T-celler är en typ av immunceller som är en viktig del av vårt immunförsvar, men som också har ett finger med i spelet vid utveckling av ledgångsreumatism. Målet med det här mastersprojektet var att utveckla en cellbaserad metod för att läsa av aktiviteten hos det här proteinet som har getts kodnamnet GHOST. Ett stort antal prov måste kunna läsas av samtidigt för att eventuellt senare kunna användas i en screening av potentiella läkemedelskandidater. Ett annat mål var att validera GHOST som målprotein, och se om dess proteinnivåer verkligen påverkar T-cellsreaktiviteten.

Principen bakom metoden som utvecklades var baserad på GHOSTs förmåga att göra om ett ämne till ett annat. Det ämne som bildas absorberar ljus vid en viss våglängd och med hjälp av en spektrofotometer kan man följa ökningen av absorbans vid den här våglängden över tid. Absorbansökningen över tid motsvarar då hastigheten det tar för det nya ämnet att bildas, vilket i sin tur är det samma som GHOSTs aktivitet. När de naturliga nivåerna av GHOST ökades i en HepG2 cellinje, ökade också hastigheten för formationen av det nya ämnet. Likaså om nivåerna av GHOST minskades i samma cellinje, så minskade formationshastigheten av det nya ämnet. Metoden kunde då användas för att mäta aktiviteten hos GHOST. Dock visade det sig att den här metoden är tidsberoende, vilket är ett problem i stora screeningar.

Under valideringen av GHOST som målprotein användes T-celler från råttmjälte. Det visade sig att både ökning och minskning av mängden GHOST minskade den reaktiva signaleringen hos T-cellerna. Även toxicitetstestet som gjordes visade motstridiga resultat, därför kunde ingen slutsats dras om huruvida ökning eller minskning av GHOSTs nivåer var att föredra. Dock pekar resultaten på att det kan vara fördelaktigt ur inflammationssynpunkt att påverka GHOST-nivåerna, även om det är oklart hur det ska göras. Fler experiment och fortsatt forskning kommer krävas för att få en bättre validering av GHOST som ett målprotein för behandling av ledgångsreumatism.

Handledare: Therese Lindvall, Peter Olofsson, Redoxis AB
Examensarbete för masterexamen, cell- och molekylärbiologi, 30 hp, 2013
Biologiska institutionen, Lunds universitet

• author: Danielsson, Hanna
• supervisor: Therese Lindvall; Peter Olofsson
• organization: Degree Projects in Molecular Biology
• course: MOBM15 20122
• year: 2013
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Biology and Life Sciences
• language: English
• id: 3563372
• date added to LUP: 2013-03-11 15:31:22
• date last changed: 2013-03-11 15:31:22