Genomic and metabolic response of citrate in human lung fibroblasts

Abstract

Objective: Citrate is widely used in dialysis, either as an acid in dialysis fluids or as a regional anticoagulant. In both cases, the concentration of citrate in the plasma of the patients will increase above physiological levels, up to 5-foldes in some cases. The aim of this study was to investigate the effect of citrate on the transcriptional level, as well as on the metabolic level and elucidate the effects of citrate on central metabolic pathways in human lung fibroblast cells (MRC-5).

Method: A whole genome expression analysis (Affymetrix) was performed on MRC-5 cells incubated with 0, 1, or 8 mM citrate for 1, 4, and 24 h. Then, the intracellular level of different metabolic intermediators was measured after incubation with different concentrations of citrate (1, 2, 4, or 8 mM) including 2-phosphoglycerate, pyruvate, citrate, succinate, phosphatidylcholine, lactate, ATP, and NADH using enzymatic assays. The effect of citrate on cell viability was monitored by a real-time RTCA system during two conditions; starvation and induced oxidative stress.

Results: The gene expression changes in central metabolic pathways related to the metabolism of citrate indicated that few genes were affected upon addition of citrate. The metabolic intermediators that was investigated including succinate, NADH, pyruvate, and citrate indicated a tendency to increase in cells treated with high concentration of citrate (4 and 8 mM). Cells treated with 1-4 mM citrate indicated an increased production of ATP whereas cells treated with 8 mM citrate showed a decreased ATP production. The cell viability data showed that citrate had the potential to improve cell viability during oxidative stress.
Conclusion: Increased extracellular citrate affected few genes involved in central metabolic pathways such as the glycolysis, TCA cycle, and electron transport chain in MRC-5 cells. Although, elevated level of citrate did affect the levels of different metabolites during treatment of citrate. In addition, treatment of 1-4 mM citrate increased the ATP level, suggesting that citrate is metabolized through the TCA cycle, and consequently enhances the production of ATP. The results suggested that citrate could protect against oxidative stress and also be used as an energy source during cell starvation.

Popular Abstract (Swedish)

Citrat ger cellerna mer energi

Njurarna är ett organ i kroppen vars huvuduppgift är att avlägsna överflödig vätska och rena blodet från restprodukter. Njursvikt innebär ett tillstånd där njurarna helt eller till största delen förlorat sin funktion och kan leda till ett livshotande tillstånd då vätskenivån i kroppen ökar. Detta kan bl.a. leda till ett förhöjt blodtryck och att nivån av olika giftiga ämnen som annars avlägsnat via urinen blir så pass höga att de når skadliga nivåer i blodet. En person med långt framskriden eller akut njursvikt kommer att behöva genomgå en njurtransplantation, alternativt påbörja dialysbehandling. Bloddialys är en behandlingsmetod som innebär att blodet renas utanför kroppen, i en maskin som kan jämföras med en konstgjord njure. Vid dialysbehandling cirkuleras patientens blod över ett filter utanför kroppen via en dialysmaskin. För att blodet inte ska stelna och täppa igen dialysfiltret under behandlingen, ges patienten antikoagulation vid varje behandlingstillfälle. Heparin har länge varit ett förstahandsval, men är associerad med flera nackdelar då den även hindar blodet från att stelna inuti kroppen och kan därmed öka risken för inre blödningar. Ett alternativ till heparin är citrat, som istället fungerar regionalt dvs. endast i blodet som är utanför kroppen under dialysbehandlingen. Citrat används dessutom i vissa dialysvätskor för att få rätt pH. Vid användning av citrat kommer patientens nivå av citrat i blodet att öka.

I senare studier har det visat sig att citrat inte bara minskar blödningsrisken, utan också har andra positiva egenskaper, som t.ex. minskad inflammation och minskad dödlighet hos dialyspatienter. Syftet med detta arbete var att undersöka underliggande mekanismen för dessa positiva effekter av citrat samt vad som egentligen händer när citratnivåerna i blodet ökar. För att göra detta användes humana celler som blev utsatta för olika koncentrationer av citrat.

Gener bestämmer vilka ämnen som ska produceras i cellen och nivån av generna bestämmer i sin tur hur mycket av ämnena som ska bildas. Det finns väldigt många gener men bara några få gener visade sig påverkas av att cellerna blev utsatta för citrat. Citrat är en central del av cellernas energiomvandling och deltar i flera olika energiproducerande vägar. Resultaten i denna studie kunde visa att genom tillsatts av citrat till cellerna kunde energiproduktion ökas och dessutom även öka nivåer av andra ämnen som är involverade i energiomvandlingen.

Som en slutsats kan en förhöjd citratnivå öka energiproduktionen, vilket i sin tur kan bidra till en ökad cellöverlevnad. Det kunde även visas att förbehandling av citrat i odlingssubstratet verkar skydda mot oxidativ stress samt en snabbare återhämtning från oxidativ skada. En anledning till att citrat kan minska skada vid oxidativ stress kan vara genom omvandling av citrat till ett annat ämne som kallas pyruvat. Pyruvat har sedan länge varit känd som en antioxidant och kan skydda cellerna mot oxidativ förstörelse. Sammanfattningsvis är en bredare förståelse för hur en ökad citratnivå påverkar cellerna viktig, då det finns en möjlighet att förbättra användningen av citrat, men också för att i större mån utnyttja de positiva egenskaperna av citrat som har uppvisats.

Handledare: Anna Bryland, Bodil Sjögreen
Examensarbete masterexamen 60 hp i medicinsk biologi, 2015/2016
Biologiska institutionen, Lunds universitet
Baxter International Inc.

• author: Willysson, Annie
• supervisor: Anna Bryland
• organization: Degree Projects in Molecular Biology
• course: MOBT01 20152
• year: 2016
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Biology and Life Sciences
• language: English
• id: 8891818
• date added to LUP: 2016-09-15 12:41:53
• date last changed: 2016-09-15 12:41:53