Gene-ID Using Simultaneous DNA Barcoding and Enzymatic Labeling

Abstract

Antibiotic resistance is an ever growing problem, and is considered one of the major challenges of modern medicine. In order to avoid further development and spread of multiresistance among bacteria, the use of antibiotics should be more restrictive, and more tailored to individual cases of infection. To facilitate more directed treatments, it is crucial to be able to quickly and reliably identify the strain of bacteria. A logical next step would be to directly be able to identify any genes coding for antibiotic resistance.

To this end, I investigate the possibility of combining two methods of optical mapping of plasmids - DNA barcoding, and enzymatic labeling of specific genes. The end goal is to develop a single experiment in which both the plasmid type, and any genes coding for antibiotic resistance, can be identified.

I focus mainly on three tasks - all related to the processing of experimental data. (1) Improving an earlier method for kymograph alignment, necessary for processing data from experiments using DNA in nanochannels. (2) Creating reproducible time averages of sparsely labeled barcodes, by attempting to exclude non emitting fluorophores. (3) Determining the number of fluorophores in a sparsely labeled barcode, by fitting a number of Gaussians to its reproducible time average.

The results of all three tasks were promising, but as no data was available of plasmids labeled using both techniques of optical mapping, no definitive conclusions could be made about the approach.

Popular Abstract (Swedish)

Plasmider är korta cirkulära DNA-molekyler, som kan hittas i de flesta bakterier. Detta projekt handlar om att skapa och testa ett nytt sätt att identifiera plasmider, samt specifika gener på dessa. Principen bygger på att kombinera en tidigare metod kallad “Competitive binding-based optical DNA mapping”, och infärgning av en längre DNA-sekvens med fluoroscerande (självlysande) molekyler, för att kunna avgöra huruvida specifika gener är närvarande eller inte. Detta tillvägagångssätt vore potentiellt betydligt snabbare än traditionell DNA-sekvensering, vilket är av stor relevans bland annat då det ska avgöras huruvida antibiotikaresistens är närvarande i en population av bakterier. I längden kan detta leda till effektivare behandlingar av infektioner, vilket blir allt mer relevant allteftersom antibiotikaresistens blir vanligare. Mina uppgifter i projektet är att utveckla metoder och programvara för analys av filmer av färgade DNA-molekyler, som tagits med hjälp av fluorescens-mikroskop.

Competitive binding-based optical DNA mapping går ut på att låta de två ämnena YOYO-1 och netropsin binda till en DNA-molekyl. YOYO är en fluorescerande molekyl, som kan binda till vilken DNA-sekvens som helst. Netropsin däremot är icke-fluorescerande, men binder endast till specifika fyra baspar långa sekvenser. Om en längre bit utsträckt DNA, efter markering med YOYO och netropsin, observeras under mikroskop så kommer den att likna en ”streckkod” med mörka band där netropsin bundit, och lysande band där endast YOYO är närvarande. DNA från olika organismer kommer att uppvisa olika band, eller olika streckkoder, och kan därmed identifieras.

Inom detta projekt undersöks möjligheten att sedan även använda ett enzymbaserat molekylkomplex för att färga in längre DNA-sekvenser, framförallt de som kodar för antibiotikaresistens. Genom att observera om och var dessa komplex bundit till DNA:t, och hur den uppkomna streckkoden ser ut, kan det snabbt identifieras vilken bakterieart det handlar om, och huruvida den är resistent mot en viss typ av antibiotika. Detta arbete syftar till att undersöka hur pålitlig och användbar en sådan metod skulle vara. På längre sikt skulle tekniken kunna bli tillräckligt snabb och praktisk för att användas för att undersöka de bakterier enskilda patienter infekterats av. Med hjälp av detta skulle skräddarsydda antibiotikakurer kunna väljas ut, vilket skulle kunna spara tid, lidande och resurser, och dessutom minska riskerna för ytterligare utvecklande och spridning av antibiotikaresistens.

De experimentella data som används har erhållits från Fredrik Westerlunds grupp vid Chalmers tekniska högskola och Robert Neelys grupp vid Universitetet i Birmingham, i form av korta filmer av utsträckta DNA-plasmider under mikroskop, då de färgats med ämnena beskrivna ovan. Dessa filmer har bearbetas med tidigare utvecklad programvara, så att en tvådimensionell bild, så kallad ”kymograf”, av varje DNA-sträng erhålles. X-ledet i dessa bilder representerar positionen längs med DNA-strängen, medan y-ledet representerar tid, med varje rad (varje pixel i y-led) innehållande data från en bildruta (”frame”) ur filmen.

Då DNA-molekylerna inte är helt stilla under experimentet (Westerlund-gruppens experiment), utan sträcker ut och drar ihop sig både lokalt och globalt, och flyttar sig i sidled, är de uppkomna streckkoderna inte särskilt tydliga i kymograferna innan vidare behandling. Den första delen av mitt arbete bestod därför av att förbättra en metod för att kompensera för dessa rörelser, eller att ”räta ut” streckkoderna. Därefter utvecklades en metod för att även ta i beaktning att fluoroforer slumpmässigt kan ”slå på eller av” under ett experiments gång (experiment från Robert Neelys grupp). För att finna intensiteten av emitterat ljus, måste medelvärden tas endast från den del av experimentet då molekylen ”är på”.

• author: Nordanger, Henrik
• supervisor: Tobias Ambjörnsson
• organization: Department of Astronomy and Theoretical Physics - Undergoing reorganization
• course: FYTM03 20162
• year: 2017
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Physics and Astronomy
• keywords: Antibiotic resistance, Enzymatic labeling, Plasmids, Optical DNA mapping
• report number: LU TP 17-06
• language: English
• id: 8905270
• date added to LUP: 2017-04-04 16:51:00
• date last changed: 2017-04-04 16:51:00