Skip to main content

LUP Student Papers

LUND UNIVERSITY LIBRARIES

Identification of Cell-Based Reporter Assays for Ligand Screening of PDZ- and Agonist-Dependent GPR30 Activity

Alexandrakis Eilard, Ioannis (2018) MOBN03 20172
Degree Projects in Molecular Biology
Abstract
G protein-coupled receptor 30 (GPR30) is a ubiquitously expressed receptor reported to bind and become activated by estrogen (17β-estradiol). However, the role of GPR30 as an estrogen receptor for rapid estrogenic signaling is not completely accepted, and controversies exist regarding the identity of the cognate ligand, signaling, and subcellular localization of the receptor. Expression of GPR30 in breast cancer correlates positively with increased tumor size and degree of metastasis; and receptor expression in the plasma membrane is a strong independent predictor for decreased survival of breast cancer patients. Since controversies exist regarding the cognate ligand to the receptor, the aim of this Master´s degree project was to identify... (More)
G protein-coupled receptor 30 (GPR30) is a ubiquitously expressed receptor reported to bind and become activated by estrogen (17β-estradiol). However, the role of GPR30 as an estrogen receptor for rapid estrogenic signaling is not completely accepted, and controversies exist regarding the identity of the cognate ligand, signaling, and subcellular localization of the receptor. Expression of GPR30 in breast cancer correlates positively with increased tumor size and degree of metastasis; and receptor expression in the plasma membrane is a strong independent predictor for decreased survival of breast cancer patients. Since controversies exist regarding the cognate ligand to the receptor, the aim of this Master´s degree project was to identify a cell-based system that could be used for high-throughput screening (HTS) of peptide and small-molecule substance libraries for the identification of GPR30 ligands. Two cell-based systems were evaluated for this purpose; a luciferase-based promoter-reporter system previously used for GPCR-ligand screening, and a yeast growth-based system. For the promoter-reporter system, only a slight, yet significant GPR30-dependent effect was observed when cells transiently expressing the receptor were treated with the proposed GPR30-specific agonist G-1. No GPR30-dependent effect was observed when yeast cells expressing the receptor were subjected to 1 μM G-1. However, a significant receptor-dependent constitutive activity in yeast growth was observed. These were only preliminary results from a pilot study performed on the yeast-based reporter system. The effects observed with G-1 in these two cell-systems were not convincing. Further research should be conducted to establish a HTS-system for the identification of GPR30 ligands. (Less)
Popular Abstract
GPR30 – En gåtfull cellreceptor involverad i bröstcancer

Det råder ingen tvekan om hur viktig en väl fungerande kommunikation är människor sinsemellan. Något som blir extra tydligt då det budskap vi vill förmedla missuppfattas eller misstolkas. Faktum är att de celler vi (och allt annat biologiskt liv) är uppbyggda av också behöver kunna kommunicera sinsemellan för att kunna upprätthålla liv.

Cellkommunikation möjliggörs via en arsenal av olika proteinstrukturer (receptorer) som sitter fast på cellytan. En cellreceptor kan liknas vid en antenn, som fångar upp en signal som en annan cell har skickat ut. I en biologisk kontext så utgörs denna signal av diverse molekyler, så som t.ex. hormoner. Då en signalmolekyl fångas upp av... (More)
GPR30 – En gåtfull cellreceptor involverad i bröstcancer

Det råder ingen tvekan om hur viktig en väl fungerande kommunikation är människor sinsemellan. Något som blir extra tydligt då det budskap vi vill förmedla missuppfattas eller misstolkas. Faktum är att de celler vi (och allt annat biologiskt liv) är uppbyggda av också behöver kunna kommunicera sinsemellan för att kunna upprätthålla liv.

Cellkommunikation möjliggörs via en arsenal av olika proteinstrukturer (receptorer) som sitter fast på cellytan. En cellreceptor kan liknas vid en antenn, som fångar upp en signal som en annan cell har skickat ut. I en biologisk kontext så utgörs denna signal av diverse molekyler, så som t.ex. hormoner. Då en signalmolekyl fångas upp av antennen (binder till och aktiverar receptorn) förmedlas ett budskap till cellen, vilken i sin tur svarar på budskapet genom att reglera diverse cellparametrar. Cellreceptorer är ytterst specifika, och kan enbart detektera signaler från en enskild signalmolekyl eller signalmolekylgrupp. Därför krävs det att en cell har många olika slags receptorer på sin yta, för att på så vis kunna mottaga olika typer av information från sin omgivning. Defekter i cellkommunikationssystemet kan leda till sjukdom, så som exempelvis olika former av cancer.

I mitt projekt har jag studerat en cellreceptor, GPR30, som tillhör receptorfamiljen G protein-kopplade receptorer. En övervägande del av den forskning som gjorts på GPR30 tyder på att receptorn binder till och aktiveras av en viss sorts östrogenhormon, 17β-estradiol. Dock råder det delade uppfattningar om detta mellan olika forskargrupper inom fältet. Vidare så har man funnit att GPR30 kan användas som en prognostisk markör för primär bröstcancer, där patienter som har högt uttryck av receptorn på cellytan har sämre långsiktiga överlevnadschanser. Projektet går ut på att utveckla och testa cellbaserade system som kan användas för att hitta signalmolekyler, ligander, som binder till och aktiverar GPR30. Sådana cellsystem möjliggör s.k. high-throughput screening av GPR30-ligander, vilket innebär att man på kort tid kan testa ett stort antal olika molekyler om de kan binda och aktivera GPR30. För att genomföra detta har man med molekylärbiologiska metoder designat celler så att de avger en mätbar signal då en ligand aktiverar receptorn (se fig. 1). Totalt testades två olika cellsystem, ett som var baserat på humana celler och ett som var baserat på jästceller.

Syftet med att utveckla en high-throughput screening-metod är att effektivisera processen med att hitta ligander som kan aktivera eller blockera GPR30, en process som utan ett high-throughput screening-system hade varit tids- och kostnadsmässigt omöjlig att genomföra. Att identifiera en ligand till GPR30 är av stort intresse, dels ur ett grundforskningsperspektiv (att förstå hur GPR30 fungerar) och dels ur ett kliniskt perspektiv, då cellreceptorn är involverad bland annat i progressionen av viss bröstcancer.

Resultat och slutsats
Jag fann att cellsystemet som var baserat på humana celler, till viss del, kunde påvisa ligand-aktivering av GPR30. Dock var den observerade effekten av aktiveringen relativt liten. Vidare studier bör därför genomföras för att förbättra detta cellsystem. Då det gäller cellsystemet som var baserat på jästceller, så kunde en ligand-aktivering av GPR30 inte påvisas. Det bör tilläggas att det jästbaserade systemet var i en tidig utvecklingsfas och att enbart ett pilotexperiment genomfördes. Emellertid gick det att med det jästbaserade systemet påvisa en s.k. konstitutiv aktivering av GPR30, vilket innebär att GPR30 utan att bli aktiverad av en ligand, kan ha en mätbar basalaktivitet. Därför skulle en ligand som hämmar denna aktivitet (så kallad invers agonist) kunna identifieras. Sammanfattningsvis, så måste de båda cellsystemen fortsätta att utvecklas innan de kan användas som tillförlitliga high-throughput screening-metoder, för identifiering av GPR30-ligander.

Master’s Degree Project in Molecular Biology, 60 credits, 2018
Department of Biology, Lund University
Advisor: Fredrik Leeb-Lundberg
Drug Target Discovery, Experimental Medical Science (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
Alexandrakis Eilard, Ioannis
supervisor
organization
course
MOBN03 20172
year
type
H2 - Master's Degree (Two Years)
subject
language
English
id
8960309
date added to LUP
2018-10-16 10:03:24
date last changed
2018-10-16 10:03:24
@misc{8960309,
  abstract     = {{G protein-coupled receptor 30 (GPR30) is a ubiquitously expressed receptor reported to bind and become activated by estrogen (17β-estradiol). However, the role of GPR30 as an estrogen receptor for rapid estrogenic signaling is not completely accepted, and controversies exist regarding the identity of the cognate ligand, signaling, and subcellular localization of the receptor. Expression of GPR30 in breast cancer correlates positively with increased tumor size and degree of metastasis; and receptor expression in the plasma membrane is a strong independent predictor for decreased survival of breast cancer patients. Since controversies exist regarding the cognate ligand to the receptor, the aim of this Master´s degree project was to identify a cell-based system that could be used for high-throughput screening (HTS) of peptide and small-molecule substance libraries for the identification of GPR30 ligands. Two cell-based systems were evaluated for this purpose; a luciferase-based promoter-reporter system previously used for GPCR-ligand screening, and a yeast growth-based system. For the promoter-reporter system, only a slight, yet significant GPR30-dependent effect was observed when cells transiently expressing the receptor were treated with the proposed GPR30-specific agonist G-1. No GPR30-dependent effect was observed when yeast cells expressing the receptor were subjected to 1 μM G-1. However, a significant receptor-dependent constitutive activity in yeast growth was observed. These were only preliminary results from a pilot study performed on the yeast-based reporter system. The effects observed with G-1 in these two cell-systems were not convincing. Further research should be conducted to establish a HTS-system for the identification of GPR30 ligands.}},
  author       = {{Alexandrakis Eilard, Ioannis}},
  language     = {{eng}},
  note         = {{Student Paper}},
  title        = {{Identification of Cell-Based Reporter Assays for Ligand Screening of PDZ- and Agonist-Dependent GPR30 Activity}},
  year         = {{2018}},
}