Skip to main content

LUP Student Papers

LUND UNIVERSITY LIBRARIES

Disruption of ompT in Escherichia coli using phage λ Red recombinase

Sjöström, Viola (2018) MOBK01 20181
Degree Projects in Molecular Biology
Popular Abstract (Swedish)
Spelar enzymerna verkligen någon roll?

Bakterien Escherichia coli, mer känd som E. coli är till stor hjälp vid många processer för produktion av proteiner. E. colis inre maskinerier kan utnyttjas för att producera proteiner som vi människor behöver. Produktion av proteiner med E. coli är viktig för att kunna producera vissa läkemedel; till exempel proteinet insulin. Insulin är ovärderligt för de som använder sig av läkemedlet. Därför är det också viktigt att bakteriens produktion av proteiner är så effektiv som möjligt för att lätt kunna göra dem tillgängliga för många människor. Generna ompT och lon kodar för två enzymer med samma namn. Dessa enzymer bryter ner proteiner i E. coli, vilket kan vara ett problem, då de bryter ner... (More)
Spelar enzymerna verkligen någon roll?

Bakterien Escherichia coli, mer känd som E. coli är till stor hjälp vid många processer för produktion av proteiner. E. colis inre maskinerier kan utnyttjas för att producera proteiner som vi människor behöver. Produktion av proteiner med E. coli är viktig för att kunna producera vissa läkemedel; till exempel proteinet insulin. Insulin är ovärderligt för de som använder sig av läkemedlet. Därför är det också viktigt att bakteriens produktion av proteiner är så effektiv som möjligt för att lätt kunna göra dem tillgängliga för många människor. Generna ompT och lon kodar för två enzymer med samma namn. Dessa enzymer bryter ner proteiner i E. coli, vilket kan vara ett problem, då de bryter ner proteiner som man manipulerat cellerna att tillverka. För att hindra nedbrytningen av de proteiner så använder industrier ofta bakteriestammar som saknar enzymerna OmpT och Lon. Men påverkar dessa enzymer verkligen hur mycket protein som kan extraheras från bakterierna? Denna frågeställning ville vi försöka besvara i vårt arbete.

För att undersöka hur enzymernas närvaro påverkar mängden protein som produceras ville vi jämföra bakterier som saknar OmpT och Lon med bakterier som inte gör det. För att kunna ta bort de gener som kodar för enzymerna använde vi ett virussystem som heter λ-red-rekombinas. Detta system härstammar från bakterieviruset λ och används av viruset till att sätta in sitt eget DNA i bakteriers genom. Denna funktion kan utnyttjas för att ersätta gener, som exempelvis ompT, med specialdesignade DNA-strängar. Det DNA vi ersatte ompT:s plats med innehåller en gen som ger bakterien resistens mot antibiotikan kloramfenikol, vilket tillåter oss att selektera ut de bakterier som genomgått ett lyckat utbyte. Utöver genen som ger kloramfenikolresistens, innehöll DNA:t även två så kallade FRT-regioner på varsin sida om resistensgenen, vilka känns igen av proteinet flippas. Flippas funktion är att klippa ut sekvenser mellan FRT-regioner. Om utbytet av ompT lyckas, kan man därmed klippa ut resistensgenen med hjälp av flippas.

För att lätt kunna mäta hur mycket protein E. coli producerar beroende på om den har kvar enzymgenerna eller inte, använder vi ett självlysande protein som är lätt att mäta mängden av. Proteinet heter GFP (green fluoresecent protein) och upptäcktes först i maneter. När proteinet bildas av bakterierna blir de olika starkt självlysande beroende på hur mycket av proteinet som uttrycks. Då kan vi jämföra mängden och därefter dra slutsatser om det är någon skillnad mellan bakteriestammarna.

I de försöken som genomfördes lyckades vi inte byta ut ompT-genen med hjälp av λ-red-rekombinaset. Därför genomfördes endast mätningar av det fluorescerande ljuset mellan grundstammen och en med ett lyckat utbyte av lon-genen. Vid mätningar av mängden GFP fanns det ingen större skillnad mellan grundstammen och den som saknade lon. Fler mätningar krävs dock för att kunna dra några slutsatser om enzymen påverkar mängden protein som kan utvinnas.

Examensarbete för kandidatexamen i Molekylärbiologi 15 hp 2018
Biologiska institutionen, Lunds Universitet
Handledare: Claes von Wachenfeldt (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
Sjöström, Viola
supervisor
organization
course
MOBK01 20181
year
type
M2 - Bachelor Degree
subject
language
English
id
8962666
date added to LUP
2018-10-31 12:01:24
date last changed
2018-10-31 12:01:24
@misc{8962666,
  author       = {{Sjöström, Viola}},
  language     = {{eng}},
  note         = {{Student Paper}},
  title        = {{Disruption of ompT in Escherichia coli using phage λ Red recombinase}},
  year         = {{2018}},
}