Automated staining and washing of cells and microvesicles using acoustic trapping

Abstract

Microfluidic systems allow for fast and precise manipulation of small volume samples in a highly controlled environment. In such a system, acoustic trapping is a powerful tool, enabling non-contact isolation of cells and microvesicles from complex media. In this technique, an ultrasonic standing wave is introduced in the microchannel. The standing wave exerts size-dependent acoustic forces on particles located in the channel, retaining them in a trapped cluster while the surrounding fluid flows through. In this study, the use of the acoustic trap as an incubation chamber for fluorescent sample labeling was investigated. The main objective was to develop a protocol for performing CD42a labeling of platelet-derived microparticles (PMPs), optimized in terms of the aspirated volume, antibody concentration and incubation time. The developed protocol was then to be tested on other samples, using more complex staining procedures. 4 MHz acoustic trapping units mounted in an AcouTrap instrument (AcouSort AB, Sweden) were used for the experiments. The results showed that the developed method was successful in producing fluorescently labeled PMP samples with high signal strength and low background levels. Furthermore, the results indicated that acoustic streaming facilitates the staining process. The streaming focuses the staining solution into the sample cluster while circulating vortices can provide the sample with unbound reagent. By using this method, the sample could be fully processed in less than ten minutes, compared to over 140 minutes using a centrifugation protocol. An in-trap protocol with double and indirect PMP staining was tested but resulted in false positive events. These were likely caused by aggregated antibodies and should be possible to avoid in future experiments. Furthermore, white blood cells could successfully be double labeled with both membrane and nuclear stains. However, further work is needed to minimize the high variation in concentration seen during the analysis of the in-trap stained samples, suspected to be caused by variations in the measurement method. To conclude, a method for performing automated and rapid staining of microvesicles and white blood cells using acoustic trapping was developed. The results suggest the acoustic trapping platform is a promising tool for performing both sample preparation and live cell studies. Possible future applications include more complex biochemical assays, taking further advantage of the low volumes and short incubation times required as well as the straightforward introduction and removal of reagents. An especially interesting application is the preparation of exosome samples, where the standard method of isolation and staining is often even more tedious than for microparticles. Here, the rapid and fully automated sample preparation enabled by the acoustic trapping platform could likely be very useful.

Popular Abstract (Swedish)

Akustisk infångning kan bli ett värdefullt verktyg i medicinsk forskning
Från ett enda blod- eller urinprov kan läkare få massvis med information om en patient - information som ger ledtrådar om allt från det allmänna hälsotillståndet till eventuell förekomst av infektioner eller inflammationer, eller huruvida patienten lider av en viss sjukdom. Detta beror på att provet innehåller massor av så kallade biomarkörer; biomolekyler som är kopplade till olika typer av sjukdomar och fysiologiska processer. Varje dag pågår intensiv forskning för att hitta ännu fler biomarkörer, så att läkare ska kunna bli ännu bättre på att till exempel diagnosticera sjukdomar eller individanpassa läkemedel. En stor utmaning i sådan forskning är att det krävs mycket förarbete innan det går att hitta det man faktiskt är intresserad av. Biomolekylen, som till exempel kan vara en speciell sorts cell eller partikel, behöver ofta isoleras ur provet och märkas in på något sätt så att den går att mäta. Vid inmärkningen används vanligtvis en fluorofor kopplad till en specialdesignad antikropp som binder till ett unikt protein på cellen eller partikeln. Då är det viktigt att tvätta bort bakgrunden av oinbundna antikroppar, så att signalen från dessa inte stör vid analysen.
Sammantaget tar standardmetoden för att förbereda ett prov för analys lång tid och kräver många manuella steg som skapar osäkerhet i resultatet. Ett alternativt sätt att isolera celler och partiklar är att använda sig av ett mikrofluidiskt system med akustisk infångning. Genom att skapa en stående akustisk våg i en mikrometerbred kanal kan man skapa en akustisk fälla som håller fast partiklarna, och på så sätt isolera dem ur provet. På detta sättet kan både processtiden och antalet manuella steg minskas, och dessutom krävs betydligt mindre volymer prov. Denna metod har bland annat använts av forskare för att isolera plättvesiklar ur blodplasma. Plättvesiklar, som är i storleksordningen några hundra nanometer, avges av blodplättar som respons på olika processer i kroppen, och har en potentiell framtid som biomarkörer för olika typer av hjärt-kärlsjukdomar i framtiden. Nackdelen är att själva infärgningen av plättvesiklarna fortfarande har behövts göra manuellt. I detta projekt utvecklades en metod för att utföra infärgningen med antikropp inuti kanalen med den akustiska fällan. Förhoppningen var att kunna automatisera och minska på tiden som krävs för hela processen, från det obehandlade plasmaprovet till isolerade och färgade plättvesiklar redo för analys. Resultatet visade att den framtagna metoden fungerar bra och de behandlade proven uppvisade stark signal med låga bakgrundsnivåer. Tiden det tar att förbereda ett plättvesikelprov kunde minskas drastiskt, från 140 minuter vid en manuell metod till under 10 minuter. Den uppmätta plättvesikelkoncentrationen varierade en del från prov till prov, men detta misstänks ha berott på mätmetoden. När det utvecklade protokollet testades på plasma som hade blivit stimulerad så att fler plättvesiklar skulle skapas blev resultatet en tydlig skillnad i plättvesikelkoncentration jämfört med ostimulerad plasma. Detta antyder att metoden fungerar bra även för kvantitativa mätningar. Metoden testades också för mer avancerade infärgnings\-protokoll där flera olika antikroppar används. Här blev resultatet inte lika tydligt då prov som var negativa ändå gav ifrån sig en positiv signal under analysen. Detta tros bero på att antikropparna hade aggregerat, alltså klumpat ihop sig, och därför också fastnade i klustret tillsammans med plättvesiklarna, något som man bör kunna undvika i framtiden. Slutligen visades att metoden också fungerar för dubbelinfärgning av vita blodceller genom ett test där både det yttre membranet och cellkärnan märktes in. Sammantaget visade sig den akustiska fällan vara en lämplig plattform för att utföra olika typer av infärgningar på ett snabbt och automatiserat sätt, vilket potentiellt minskar risken för fel orsakade av den mänskliga faktorn. Genom små anpassningar och optimeringar kan metoden sannolikt passa för en mängd olika biokemiska analyser och möjliggöra att man sparar både provvolymer och tid. Detta innebär att forskare behöver använda mindre av sin värdefulla arbetstid på de långdragna processer som vanligtvis krävs för att förbereda prover för analys.

• author: Congiu, Jessica
• supervisor: Mikael Evander
• organization: Department of Biomedical Engineering
• course: BMEM01 20182
• year: 2018
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Technology and Engineering
• keywords: acoustic trapping, acoustofluidics, microfluidics, microvesicles, extracellular vesicles
• language: English
• additional info: 2018-19
• id: 8963738
• date added to LUP: 2019-01-14 13:59:50
• date last changed: 2019-01-14 13:59:50