Development and validation of a novel quantitative PCR analysis method for HIV-1

Abstract

The major problem when developing primers and probe sets for detection of HIV-1 is its high genetic variability and strong ability to mutate. HIV-1 is divided into four groups, M, N, O, P based on genetic similarities, and there are more than 70 different circulating recombinant forms.
The aim of this master thesis was to develop new primers and probe for a novel quantitative PCR analysis method for detection of a broad range of genotypes of HIV-1. Four target sequences with conserved parts were chosen: the pol gene at around nucleotide position 2000 in the reference sequence HXB2, the pol gene at around nucleotide position 4000, the nef gene at around nucleotide position 9000 and the gag gene at around nucleotide position 800.
The primers and probe set targeting the pol gene, pol4000, showed best potential. The primer and probe concentrations were optimized, and the best concentration on both primers and probe was 900 nM.
To test the ability to detect a broad range of genotypes of HIV a genotype test was conducted. The result showed that pol4000 could amplify all tested subgroups in group M, but failed to amplify group O and N. Detected replicates in percent from three independent assessor were compared against the average nucleotide mismatches for each genotype and a regression analysis showed that 27.5% of the detected result could be explained by nucleotide mismatches (p< 0.01).
Moreover, the results showed that there are potential in the primers and probe set, pol4000, but there is a need for further investigation to be able to determine if pol4000 will function in the new routine analysis by Octapharma AB.

Popular Abstract (Swedish)

Säkra analysmetoder hindrar HIV att sprida sig via bloddonationer
Det finns idag 38 miljoner människor i värden som lever med HIV-1, och varje dag
smittas ytterligare 5000. För att kontrollera att bloddonationer inte innehåller HIV krävs känsliga och säkra analysmetoder. Mitt arbete bidrar till att utveckla en ny analysmetod på Octapharma AB som säkerställer att plasman som används för att
framställa läkemedel är fri från HIV-1.

Om HIV-infektionen blir obehandlad så leder den sakta till immunbristsyndromet AIDS. Då är de vita blodkropparna så få att kroppen inte längre klarar av att försvara sig mot infektioner. En vanlig förkylning kan kräva omfattande läkarvård. Viruset smittar främst genom blod eller sexuell kontakt. Det finns bromsmediciner mot HIV som gör att en smittad person kan leva som vanligt men det finns inget fungerande vaccin som kan skydda mot HIV. Octapharma AB producerar läkemedel baserade på proteiner från blodplasma. Givarna går igenom samma strikta kontroller som givare på vanliga blodcentraler med intervjuer och antigen och antikroppstester, och därmed är det ytterst sällsynt att smittade givare slinker igenom. Det kan ta lite tid innan kroppen har hunnit utveckla antikroppar så en väldigt nysmittat person kan eventuellt missas vid ett antikroppstest. För att verkligen säkerställa att det framställda läkemedlet inte innehåller virus som kan smitta patienten i slutänden behöver både ingående och poolad plasma kontrolleras ytterligare för virus. De virus som kontrolleras är hepatit A, B, C och E, samt B19V och HIV-1.

Varje gång en ny HIV partikel bildas så uppstår det en mutation i virusets arvsmassa. Detta medför att det finns väldigt många olika grupper och subgrupper typer av HIV med olika genetiska koder. Jag har försökt utveckla en ny metod för att kunna hitta så många varianter som möjligt av HIV i blodplasma.

Min metod lyckades hitta de vanligaste typerna av HIV men inte alla. Vidareutveckling av metoden behövs för att öka säkerheten och möjligheten att hitta en bredare skara av olika HIV typer.

Den metod jag utvecklade bygger på kvantitativ PCR som är en metod som kopierar DNA
många gånger så att mängden ökar. För att metoden ska vara specifik och veta vilket DNA som ska kopieras tillsätter man något som kallas för primrar. En primer är en liten enkelsträngad del av en DNA sekvens. Dessa är designade att match på specifika platser i HIVs genetiska kod. Detta gör att ett enzym som kopierar DNA kan fungera. För att kunna hitta så många olika typer av HIV som möjligt måste primrarna vara designade för att kunna matcha med delar av HIV-viruset som är konserverade, dvs fria från mutationer. För att vi ska kunna avgöra om PCR reaktionen har hittat HIV så tillsätts prober som är designad att binda in mellan varje primer par. När enzymet sen kopierar över proben så ger den ifrån sig ljus som kan mätas och på så vis vet vi att HIV i provet.

• author: Sundgren, Josefine
• supervisor: Johan Svensson Bonde
• organization: Pure and Applied Biochemistry; Computational Chemistry
• course: KBKM05 20201
• year: 2020
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Technology and Engineering
• keywords: HIV-1, qPCR, Octapharma, Taqman, applied biochemistry, tillämpad biokemi
• language: English
• id: 9015588
• date added to LUP: 2020-06-12 16:52:00
• date last changed: 2020-06-12 16:52:00