Overexpression and purification of MSP2N2 for nanodisc assembly and reconstitution of TRPA1
(2021) MOBY01 20211Degree Projects in Molecular Biology
- Abstract
- Membrane proteins are important building blocks for several biochemical processes. The difficulty with membrane proteins is that they tend to be lowly expressed and can be difficult to manage. Therefore, membrane proteins are studied to a lesser extent than soluble proteins. Since membrane proteins are intrinsically hydrophobic, their purification and structural determination critically rely on solubilization by detergents or other alternative procedures, such as nanodiscs. The purpose of this project is to overexpress and purify a membrane scaffold protein (MSP2N2) to allow assembly of nanodiscs, which in turn can help determine the structure of a membrane protein, namely a Transient Receptor Potential cation channel A1 (TRPA1) from... (More)
- Membrane proteins are important building blocks for several biochemical processes. The difficulty with membrane proteins is that they tend to be lowly expressed and can be difficult to manage. Therefore, membrane proteins are studied to a lesser extent than soluble proteins. Since membrane proteins are intrinsically hydrophobic, their purification and structural determination critically rely on solubilization by detergents or other alternative procedures, such as nanodiscs. The purpose of this project is to overexpress and purify a membrane scaffold protein (MSP2N2) to allow assembly of nanodiscs, which in turn can help determine the structure of a membrane protein, namely a Transient Receptor Potential cation channel A1 (TRPA1) from Hylobius abietis. The initial results presented in this study shows the difficulty of producing MSP2N2 in terms of contaminants and degradation. These findings provide development opportunities for how to successfully isolate MSP2N2 for further use. (Less)
- Popular Abstract (Swedish)
- Produktion av stödprotein för vidare strukturbestämning av jonkanal
Vi människor precis som alla andra levande organismer består av pyttesmå celler. Dessa celler har ett membran, ett hölje som avdelar cellens inre miljö från dess yttre. Celler behöver kunna utbyta ämnen och kommunicera med sin omgivning och därför finns proteiner i membranet som fyller denna funktion, nämligen membranproteiner. Antalet membranproteiner som man vet strukturen av är dock få, främst för att dessa proteiner generellt sett är instabila och svåra att hantera.
Det långsiktiga målet med det här projektet är försöka ta reda på strukturen av ett membranprotein som kallas för Wasabi Receptorn (TRPA1) och är en slags jonkanal. Tidigare har man lyckats få fram... (More) - Produktion av stödprotein för vidare strukturbestämning av jonkanal
Vi människor precis som alla andra levande organismer består av pyttesmå celler. Dessa celler har ett membran, ett hölje som avdelar cellens inre miljö från dess yttre. Celler behöver kunna utbyta ämnen och kommunicera med sin omgivning och därför finns proteiner i membranet som fyller denna funktion, nämligen membranproteiner. Antalet membranproteiner som man vet strukturen av är dock få, främst för att dessa proteiner generellt sett är instabila och svåra att hantera.
Det långsiktiga målet med det här projektet är försöka ta reda på strukturen av ett membranprotein som kallas för Wasabi Receptorn (TRPA1) och är en slags jonkanal. Tidigare har man lyckats få fram strukturen på den mänskliga versionen av Wasabi receptorn och nu vill man på samma sätt försöka få fram Wasabi Receptorn från snytbagge. Detta för att snytbaggen orsakar skador på granplantor, och med hjälp av strukturen kan man då utveckla alternativ till besprutningsmedel som är giftiga. Det är även intressant att jämföra Wasabi receptorn från olika arter för att kunna lära sig mer om proteinet, vilket kan vara betydelsefullt för framtida läkemedel mot smärta.
Eftersom dessa proteiner är svåra att hantera så vill man skapa en miljö som gör Wasabi receptorn mer lätthanterlig. Ett sätt är att producera något som kallas för nanodiskar som man kan sätta in Wasabi receptorn i. Nanodiskar erbjuder proteinet en stabil miljö och består av ett fettlager som omsluts av ett annat protein, ett Membrane Scaffold Protein (MSP). Det huvudsakliga syftet med detta projekt är att producera ett MSP, för att kunna skapa nanodiskar och därmed underlätta för strukturbestämning av Wasabi receptorn.
För att möjliggöra detta har vi använt en bakterie, Escherichia coli, som gör MSP (ett modifierad mänskligt protein). Bakterien har odlats upp och eftersom MSP har förlängts med en svans som gör att den kan fastna till ett gelmaterial så kan proteinet isoleras. MSP identifieras med Coomassie gel och Western blot, två tekniker där man låter proteiner vandra i ett elektriskt fält och separeras baserat på storlek. För att se alla proteiner färgas de in med blå färg på Coomassie gelen medan antikroppar känner igen förlängningen av proteinet i Western blot.
Slutsaten man kunde dra från identifieringen var att man endast såg MSP svagt, men att man även kunde se andra proteiner. Dessa identifierades med masspektrometri. Då kunde man se att proteinerna naturligt hade liknande förlängningar, vilket förklarar varför de fastnade till gelmaterialet. Därför bör man utforska fler sätt att producera proteinet för att kunna isolera MSP ensamt.
Handledare: Urban Johanson
Examensarbete i molekylärbiologi 30 hp 2021
Centrum för Molekylär Proteinvetenskap (CMPS), Lunds universitet (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
http://lup.lub.lu.se/student-papers/record/9060340
- author
- Bäckström, Isabelle
- supervisor
- organization
- course
- MOBY01 20211
- year
- 2021
- type
- M2 - Bachelor Degree
- subject
- language
- English
- id
- 9060340
- date added to LUP
- 2021-07-01 12:23:43
- date last changed
- 2021-07-01 12:23:43
@misc{9060340,
abstract = {{Membrane proteins are important building blocks for several biochemical processes. The difficulty with membrane proteins is that they tend to be lowly expressed and can be difficult to manage. Therefore, membrane proteins are studied to a lesser extent than soluble proteins. Since membrane proteins are intrinsically hydrophobic, their purification and structural determination critically rely on solubilization by detergents or other alternative procedures, such as nanodiscs. The purpose of this project is to overexpress and purify a membrane scaffold protein (MSP2N2) to allow assembly of nanodiscs, which in turn can help determine the structure of a membrane protein, namely a Transient Receptor Potential cation channel A1 (TRPA1) from Hylobius abietis. The initial results presented in this study shows the difficulty of producing MSP2N2 in terms of contaminants and degradation. These findings provide development opportunities for how to successfully isolate MSP2N2 for further use.}},
author = {{Bäckström, Isabelle}},
language = {{eng}},
note = {{Student Paper}},
title = {{Overexpression and purification of MSP2N2 for nanodisc assembly and reconstitution of TRPA1}},
year = {{2021}},
}