Hypoxia-induced expression of HIF-1a and GPR30, in relation to survival, proliferation and apoptosis in MCF-7 and SkBr3 breast cancer cells.

Abstract

Introduction: Hypoxia that accompanies tumor growth induces the expression of hypoxiainducible factor a (HIF-1a), in turn mediating the expression of other genes, including G
protein-coupled receptor 30 (GPR30), to promote adaption to the hypoxic microenvironment and enable cell proliferation and survival. Nonetheless, this correlation has not been causally explained.
Objective: To further investigate how breast cancer cells with expression of GPR30 adapt to hypoxia, by studying survival, proliferation, and ability to induce apoptosis.
Method: Human breast cancer cells, MCF-7 (ER-positive) and SkBr3 (ER-negative), were seeded and transfected with either GPR30 or an empty pcDNA plasmid. Transfection efficiency
was assessed by transfecting the cells with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Cells were incubated in either a hypoxic or normoxic condition, and molecular biological methods as Western blot and FACS were applied to investigate the cell´s survival, proliferation, and apoptosis induction. Mann-Whitneys U test was performed to statistically analyze intra- and inter group variations.
Results: Recombinant expression of GPR30 was reduced in hypoxic cells, and β-actin staining of those cells, as well as their PARP-cleavage, suggested cell death. Significant increased cleaving of PARP in hypoxic GPR30+ SkBr3 cells (15.5% vs 62.95%, p = 0.0286) and a significant difference between hypoxic GPR30+ SkBr3 and MCF-7 cells (p = 0.0286). GPR30+ cells also had a lower cleavage of PARP. SkBr3 cellularity was affected negatively, whilst MCF-7 cellularity was generally increased, plus more MCF-7 cells in the S-phase, in hypoxia. GPR30+ cells had a lower survival rate in hypoxia, but an increased proliferation in normoxia.
Conclusion: Our results propose a trend showing an interaction between hypoxia and GPR30, a correlation between GPR30 and a promoted proliferation in normoxia, as well as a significant difference between SkBr3 and MCF-7 in those aspects. However, our results are not enough evidence of these correlations and requires additional research.

Popular Abstract (Swedish)

Bröstcancer är av stor relevans i dagens samhälle på grund av dess höga frekvens och mortalitetsgrad. Behandling är härjämte individualiserad utifrån tumörtyp och uttryck av
hormonreceptorer. Med upptäckten av en ny receptor, GPR30, som svarar på östrogen, har forskning drivits kring hur denna samverkar med hypoxi, hur det bidrar till tumörcellernas överlevnad samt dess prognostiska och prediktiva värde. Tidigare studier har kunnat påvisa ett
samspel med HIF-1a, som uppregleras vid hypoxi, och denna interaktion uppges kunna bidra till cancercellernas överlevnad och tillväxt. För att vidare undersöka denna interaktion och få en bättre förståelse för receptorns betydelse i tumörutvecklingen, utförde vi en in vitro studie
där vi transfekterade MCF-7 (ER-positiva) och SkBr3 (ER-negativa) bröstcancerceller med antingen GPR30 eller pcDNA (kontroll) plasmid. Transfektionseffektiviteten kontrollerades med EGFP (enhanced green fluorescent protein), där ökat upptag av plasmider noterades i
SkBr3 i jämförelse med MCF-7 celler.

MCF-7 och SkBr3 cellerna placerades i antingen en hypoxikammare eller i normala förhållanden i 18 timmar. Cellerna och deras proteinuttryck analyserades sedan med Western blot, där mängden PARP i förhållande till klyvd PARP (apoptosmarkör), β-actin (proteinmängdsreferens) och GPR30 (endogent och rekombinant uttryck) kvantifierades. FACS
(flödescytometri) tillämpades för att undersöka cellernas cellcykel och proliferation. Därutöver tillämpades Mann-Whitneys U test för att statistiskt analysera resultaten och undersöka variationer mellan och inom grupperna.

Det endogena GPR30 uttrycket var högre i hypoxiska celler i jämförelse med kontrollcellerna, medan det rekombinanta uttrycket var lägre. Detta i samband med nästan icke-befintligt uttryck av β-actin hos de hypoxiska cellerna och en signifikant ökad PARP klyvning hos GPR30+ SkBr3 cellerna (intensiteten för klyvd PARP/total PARP: 15.5% vs 62.95%, p = 0.0286), tyder på att de hypoxiska cellerna har dött. Dessutom noterades en signifikant högre PARP klyvning
hos GPR30+ SkBr3 celler i jämförelse med GPR30+ MCF-7 celler i hypoxi (p = 0.0286) och att hypoxiska MCF-7 celler hade en betydligt högre överlevnadsgrad och fler celler i S-fasen.
Tillsammans indikerar dessa resultat på att MCF-7 överlever bättre i hypoxi än SkBr3 cellerna. Vi noterade dessutom en trend av att GPR30+ celler hade en lägre PARP klyvning, och att fler befann sig i S-fas vid normoxi, vilket antyder en roll hos receptorn i överlevnad och proliferation.

Utifrån de resultat vi fått, tyder vår studie på att det finns en association mellan hypoxi och GPR30 i aspekter av proliferation och överlevnad, samt att det finns en skillnad mellan hur MCF-7 och SkBr3 adapterar i hypoxiska förhållanden, vilket skulle kunna reflektera en generell
skillnad mellan ER-positiva och ER-negativa celler. Eftersom HIF-1a inte kunde framkallas, så kan denna studie inte uttala sig eller påvisa kausaliteten mellan HIF-1a och GPR30. För att få en klinisk eller vetenskaplig relevans krävs ytterligare studier och fler försök med större data.

• author: Chahin, Hanna and Jazera, Dianna
• supervisor: Julia Tutzauer
• organization: MD Programme
• alternative title: Hypoxi-inducerat uttryck av HIF-1a och GPR30, i relation till överlevnad, proliferation och apoptos av MCF-7 och SkBr3 bröstcancerceller
• course: LÄKC54 20211
• year: 2021
• type: L3 - Miscellaneous, Projetcs etc.
• subject: Medicine and Health Sciences
• keywords: hypoxia, breast cancer, GPR30 estrogen receptor
• publication/series: Hypoxia-induced expression of HIF-1a and GPR30, in relation to survival, proliferation and apoptosis in MCF-7 and SkBr3 breast cancer cells
• language: English
• id: 9063434
• date added to LUP: 2021-08-23 16:36:41
• date last changed: 2021-08-23 16:36:41