The evolutionary changes underlying spectral phenotypes of duplicated long-wavelength sensitive opsins in Lepidoptera

Abstract

Background: Color vision is enabled by visual opsins, a class of G-protein coupled receptors expressed in the eye. How well an organism discriminates color depends notably on the number of opsins, and their spectral sensitivity when bound to a light-sensitive chromophore (retinal). Spectral phenotypes have evolved convergently multiple times owing to opsin gene losses and duplications, both in vertebrates and invertebrates, which led to remarkable ways in which animals use color signals invisible to humans, for instance ultraviolet or far-red vision. In several insect lepidopteran families, a duplication of the long wave sensitive (LWS) opsin gene resulted in a second LWS opsin gene. However, the opsin functions and molecular mechanisms underlying spectral tuning amongst duplicates remain unknown. Here I set out to investigate the spectral phenotypes of duplicated LWS opsins in a diurnal butterfly, Apodemia duryi (Riodinidae family) and a nocturnal moth, Agrotis infusa (Noctuidae family) to start revealing evolutionary changes underlying opsin spectral tuning at a molecular level.

Results: By performing helix mutations in A. duryi LWS1 opsin (λmax 540 nm), expressing then purifying the modified opsin proteins in vitro using HEK293T cells, I identified regions that have led to intermediate spectral phenotypes towards the red-absorbing A. duryi LWS2 opsin (λmax 614 nm). My results show that each helix in A. duryi LWS2 contributes a small spectral shift (4 to 9 nm) towards the red phenotype with the main contributor being helix 5 (+9 nm). I also found indications of specific spectral variant residues, directly and indirectly interacting with the retinal, that may contribute to the spectral shift.

Then I expressed the duplicated LWS opsins in A. infusa in vitro using HEK293T cells and showed that its retrogene LWS2 opsin is functional (λmax 560 nm) and exhibits a shift towards longer wavelengths compared to the green-absorbing A. infusa LWS1 (λmax 547 nm). I identified one variant residue in the retinal binding pocket that could be tested for a role in the +13 nm spectral tuning.

Conclusion: Altogether, my results suggest that there may be multiple mechanisms underlying the evolution of spectral shifts towards longer wavelengths in LWS opsins across insects. These may have in turn contributed to the large phenotypic variation in spectral sensitivity observed across insect LWS opsins, and facilitated species-specific ecological requirements, such as fine orange-red color discrimination in A. duryi butterfly eyes, or as contributors to other lightsensitive behaviors when expressed in the ocelli, as in Agrotis infusa.

Popular Abstract (Swedish)

Duplikationen av långvåglängdkänsliga opsiner i fjärilar

Människor och många andra djur upplever världen omkring de i färg, och för att kunna ha ett färgseende krävs det att man kan detektera ljus av olika våglängder. Människor, och många andra djur, kan uppfatta ljus inom det synliga spektrumet, vilket sträcker sig från blått ljus som är av kortare våglängder till rött ljus som är av längre våglängder. Ljusdetektion sker oftast genom ögonen och där finns det ett protein som heter opsin. Opsiner tillhör en familj proteiner som kallas G-proteinkopplade receptorer och de består av sju helixar. De är inte ljuskänsliga utan det krävs att en ljuskänslig kromofor, oftast ett A-vitaminderivat, är bundet till proteinet för att fotoner av ljus ska kunna fångas. Det finns tre olika klasser av opsiner: kortvåglängdkänsliga opsin, mediumvåglängdkänsliga opsin och långvåglängdkänsliga opsin. De tre klasserna är känsliga för ljus av olika våglängder, vilket betyder att de bara absorberar ljus inom ett specifikt våglängdspektrum, medan ljus som är av längre eller kortare våglängder inte kan absorberas. Det specifika absorbansspektrum som ett opsin har beror på aminosyrakompositionen av opsinproteinet och den molekylära interaktionen med den bundna kromoforen.

Insekter är en grupp djur som uppvisar en stor variation när det kommer till olika sammansättningar av opsinklasser. Historiskt hade insekter två kortvåglängdkänsliga opsiner och ett långvåglängdkänsligt opsin som möjliggjorde ultraviolettljusdetektion samt uppfattning av blått och grönt ljus. Under evolutionens gång har dock förluster och duplikationer av opsingener inträffat, där duplikationerna i vissa fall har resulterat i ett nytt opsinprotein med skiftat absorbansspektrum. I det här projektet undersöker jag genduplikationen av långvåglängdkänsliga opsingener som har skett självständigt i två olika fjärilsarter, den dagaktiva Apodemia duryi (A. duryi) och den nattaktiva Agrotis infusa (A. infusa). Syftet var att försöka ge klarhet i vilka evolutionära förändringar som ligger bakom de unika absorbansspektrumen hos opsiner på en molekylärnivå.

För att kunna undersöka de två opsingenduplikationerna skapade jag först olika vektorkonstruktioner som innehöll gensekvenserna av intresse, uttryckte proteinet in vitro och mätte absorbansspektrumet. Resultatet visade att det duplicerade långvåglängdkänsliga opsinet från A. duryi har ett absorbansspektrum som är skiftat mot längre ljusvåglängder, det röda våglängdspektrumet, än det ursprungliga opsinet som absorberar grönt ljus. Jag utförde även helixmutationer i A. duryi, där en helix från det ursprungliga långvåglängdkänsliga opsinet byttes ut mot den motsvarade helixen i det duplicerade opsinet. Helixmutationerna påvisade att alla helixar bidrar till det rödskiftade absorbansspektrumet hos det duplicerade opsinet. Särskilda aminosyror som direkt och indirekt interagerar med kromoforen, och därför kan bidra till ljuskänsligheten, har också kunnat identifieras. För den andra fjärilsarten, A. infusa, visade resultatet att det duplicerade långvåglängdkänsliga opsinet är funktionellt och har ett absorbansspektrum som är något skiftat mot längre ljusvåglängder i jämförelse med det ursprungliga opsinet. Båda absorberar dock ljus i det gröna våglängdspektrumet. En aminosyra som interagerar med kromoforen kunde också identifieras.

Slutsatsen av resultaten är att det kan finnas flera mekanismer som ligger bakom evolutionen av skiftade absorbansspektrum i långvåglängdkänsliga opsiner hos insekter. De möjliga mekanismerna kan ha varit främjande för artspecificerade ekologiska behov, så som orange-röd färgdiskriminering i ögonen hos den dagaktiva A. duryi, eller för att underlätta ljusdetektion under navigationsbeteende hos den nattaktiva A. infusa.

Masterexamensprojekt i Molekylärbiologi, 60 hp, 2022
Biologiska institutionen, Lunds universitet
Handledare: Marjorie Liénard, Funktionell zoologi

• author: Svensson, Emelie
• supervisor: Marjorie Liénard
• organization: Degree Projects in Molecular Biology
• course: MOBN03 20211
• year: 2022
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Biology and Life Sciences
• language: English
• id: 9079189
• date added to LUP: 2022-05-11 13:21:17
• date last changed: 2022-05-11 13:21:17