EXPRESSION OF SUGAR BEET HEMOGLOBIN IN PICHIA PASTORIS
(2022) KBKM05 20212Pure and Applied Biochemistry
Computational Chemistry
- Abstract
- People who don’t eat meat can suffer from iron deficiency due to the lower efficiency of absorption of non-heme iron compared to heme iron. The aim of this master thesis was to explore the possibilities of producing a plant-based alternative of heme-iron by evaluating the efficiency of expression of sugar beet hemoglobin in the methylotrophic yeast Pichia pastoris.
The gene from sugar beet hemoglobin were inserted into three different Pichia pastoris expression vectors, one for intracellular expression and two for secreted expression using both the native secretion signal from Pichia pastoris and the α-factor signal sequence from Saccharomyces cerevisiae. The three expression vectors were integrated into the Pichia pastoris genome by... (More) - People who don’t eat meat can suffer from iron deficiency due to the lower efficiency of absorption of non-heme iron compared to heme iron. The aim of this master thesis was to explore the possibilities of producing a plant-based alternative of heme-iron by evaluating the efficiency of expression of sugar beet hemoglobin in the methylotrophic yeast Pichia pastoris.
The gene from sugar beet hemoglobin were inserted into three different Pichia pastoris expression vectors, one for intracellular expression and two for secreted expression using both the native secretion signal from Pichia pastoris and the α-factor signal sequence from Saccharomyces cerevisiae. The three expression vectors were integrated into the Pichia pastoris genome by homologous recombination and the successful transformants were induced with methanol. The expressed proteins were then analyzed using SDS-PAGE.
The SDS-PAGE analysis showed no clear evidence of hemoglobin production in Pichia pastoris; however, a more sensitive analysis would need to be performed to determine if hemoglobin was produced or not. Further studies (e.g., ELISA or northern blot) would need to be performed to establish to what degree sugar beet hemoglobin is expressed in the KM71 strain of Pichia pastoris. (Less) - Popular Abstract (Swedish)
- När man tänker på hemoglobin tänker man vanligtvis på det protein som finns i blodet och som hjälper till att transportera syre från lungorna ut till kroppens alla delar. Men det är inte alla som vet att varianter av hemoglobin också finns i växter, där det hjälper till med att bland annat reglera halten kväveoxid eller transportera syre hos växten.
Hemoglobin är ett proteinkomplex med en järnatom i mitten som kan binda molekyler som exempelvis syre, men också koldioxid eller kolmonoxid. Detta examesarbete handlar framför allt om att försöka uttrycka (producera) ett växthemoglobin från sockerbeta i en jästsort som heter Pichia pastoris.
Det attraktiva med att kunna uttrycka en växtbaserad variant av hemoglobin är möjligheten då få... (More) - När man tänker på hemoglobin tänker man vanligtvis på det protein som finns i blodet och som hjälper till att transportera syre från lungorna ut till kroppens alla delar. Men det är inte alla som vet att varianter av hemoglobin också finns i växter, där det hjälper till med att bland annat reglera halten kväveoxid eller transportera syre hos växten.
Hemoglobin är ett proteinkomplex med en järnatom i mitten som kan binda molekyler som exempelvis syre, men också koldioxid eller kolmonoxid. Detta examesarbete handlar framför allt om att försöka uttrycka (producera) ett växthemoglobin från sockerbeta i en jästsort som heter Pichia pastoris.
Det attraktiva med att kunna uttrycka en växtbaserad variant av hemoglobin är möjligheten då få tillgång till en vegansk och vegetarisk järnkälla helt utan animalisk inblandning. Detta skulle göra det enklare att producera vegetabiliska livsmedel med en hög halt av järn som är ett grundämne som många veganer och vegetarianer har brist på.
I detta arbete introducerades den genen som kodar för sockerbetshemoglobin till det befintliga DNAt hos Pichia pastoris och genom att tillsätta metanol så startades produktionen av sockerbetshemoglobinet. Eftersom Pichia pastoris i normalfallet producerar egna protein också, så renades alla protein upp och analyserades i en metod som ger en översikt på storleken av de protein som finns i ett specifikt prov.
Det kunde bevisas att genen för hemoglobinet hade integrerats korrekt i genomet hos Pichia pastoris men man kunde inte se några tydliga tecken på att hemoglobin hade producerats i någon större utsträckning. Detta behöver dock inte betyda att det inte har producerats alls. För att driva forskningen på området vidare skulle det behövas utföras analyser som är känsligare än den metod som användes i detta arbete, för att kvantifiera den grad hemoglobin som har producerats. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
http://lup.lub.lu.se/student-papers/record/9100828
- author
- Pettersson, Johan LU
- supervisor
-
- Simon Christensen LU
- Leif Bülow LU
- Mats Larsson LU
- organization
- course
- KBKM05 20212
- year
- 2022
- type
- H2 - Master's Degree (Two Years)
- subject
- keywords
- Pichia pastoris, expression, sugar beet, hemoglobin, km71, ppic9, ppic3.5, phil-s1, applied biochemistry
- language
- English
- id
- 9100828
- date added to LUP
- 2022-09-26 09:07:51
- date last changed
- 2022-09-26 09:07:51
@misc{9100828,
abstract = {{People who don’t eat meat can suffer from iron deficiency due to the lower efficiency of absorption of non-heme iron compared to heme iron. The aim of this master thesis was to explore the possibilities of producing a plant-based alternative of heme-iron by evaluating the efficiency of expression of sugar beet hemoglobin in the methylotrophic yeast Pichia pastoris.
The gene from sugar beet hemoglobin were inserted into three different Pichia pastoris expression vectors, one for intracellular expression and two for secreted expression using both the native secretion signal from Pichia pastoris and the α-factor signal sequence from Saccharomyces cerevisiae. The three expression vectors were integrated into the Pichia pastoris genome by homologous recombination and the successful transformants were induced with methanol. The expressed proteins were then analyzed using SDS-PAGE.
The SDS-PAGE analysis showed no clear evidence of hemoglobin production in Pichia pastoris; however, a more sensitive analysis would need to be performed to determine if hemoglobin was produced or not. Further studies (e.g., ELISA or northern blot) would need to be performed to establish to what degree sugar beet hemoglobin is expressed in the KM71 strain of Pichia pastoris.}},
author = {{Pettersson, Johan}},
language = {{eng}},
note = {{Student Paper}},
title = {{EXPRESSION OF SUGAR BEET HEMOGLOBIN IN PICHIA PASTORIS}},
year = {{2022}},
}