Dual peptide insertion in capsid of Adeno-associated virus

Abstract

Adeno-associated virus (AAV) is in gene therapy, a widely studied viral vector for delivering therapeutic genes to cure genetic diseases. A major limitation of the wild type AAV is its broad tissue tropism, which necessitates high viral doses to achieve therapeutic efficacy in target tissue. Despite its non-pathogenic profile, high doses can cause adverse immune responses. In this study, the capsid of AAV serotype 9, notable for its ability to cross the blood-brain barrier, was modified in two specific variable regions (VRs) known to be important for tissue tropism, VR4 and VR8.

A library of 150 unique 7-mer peptides was inserted simultaneously into both VR4 and VR8, and individually into each region as controls, creating three libraries. To facilitate efficient in vivo screening, each variant was barcoded during insertion of DNA sequences encoding the peptides. Plasmid library production of the dual insertion construct revealed potential DNA assembly issues. These issues likely stem from the additional small peptide fragment in dual insertion assembly, susceptible to over digestion of T5 exonuclease. Another limitation was noticed when linking the barcode with the peptide insert of the plasmid library using sequencing. The dual insertion plasmid library requires PacBio sequencing instead of the usually used Illumina. This limits the size of the library that can be screened.

We showed that dual insertion plasmid libraries can be generated. Despite potential issues generating and sequencing larger libraries, in vivo screening might produce significant insight in effect of dual inserted peptide on tropism properties of AAV9, previously unexplored.

Popular Abstract (Swedish)

Modifierade virus ökar effektivitet i behandling av genetiska sjukdomar

Det finns virus som är helt ofarliga för oss människor som forskare har insett att man kan utnyttja till vår fördel. Detta genom att placera en fungerande version av en trasig gen, som har orsakat en sjukdom, i ett ofarligt virus och injicera det i patienten. Viruset kan sedan transportera genen till cellerna och sjukdomen botas. En viktig aspekt som det forskas mycket på är hur man kan styra viruset till rätt plats i kroppen där sjukdomen är, vilket är fokuset i denna studie.

Ett specifikt virus som används i detta syfte är Adeno-associerat Virus, AAV. Detta är mycket vanligt och de flesta har burit på det någon gång. Det orsakar ingen sjukdom och passar därför som verktyg i behandlingar av genetiska sjukdomar. Ett problem är att viruset sprider sig till stora delar av kroppen. Har man till exempel en genetisk sjukdom i musklerna så vill man att viruset ska leverera genen just dit. Om viruset samtidigt sprids till många andra vävnader krävs höga doser för att tillräckligt ska nå rätt celler. Trots att de är ofarliga, kan kroppen reagera starkt på höga halter av vilket virus som helst, vilket kan vara farligt för patienten. I denna studie utforskas en ny metod för att styra viruset till rätt ställe.

AAV viruset består av en kort DNA sekvens, där virusets gener finns, omsluten av ett proteinskal. Ytan på detta skal är viktig för virusets transport då det interagerar med omgivningen. I denna studie modifierades proteinskalet genom att sätta in korta proteinsekvenser i två specifika regioner som visats vara viktiga för virusets transportförmågor. Modifieringen görs genom att ändra i virusets DNA. I grund och botten bestämmer DNA-sekvensen vilka protein som ska bildas eftersom den kan direkt översättas till aminosyror, som bygger upp protein. Genom att förändra virusets DNA kan man påverka hur proteinet byggs och därmed hur skalet ser ut. Det unika i denna studie var att två regioner modifierades samtidigt. Flera olika varianter av viruset skapades genom att sätta in 150 unika sekvenser i båda regionerna.

De modifierade virusen hanns aldrig testas men möjligheter och problem med virus som har insättningar på två ställen upptäcktes. Att placera nya sekvenser i en DNA-sekvens görs genom att klippa och klistra med speciella protein. Ju fler sekvenser man ska sätta in desto mer komplicerat blir det att klippa och klistra. I vårt fall när två sekvenser skulle klippas in syntes denna förutspådda svårighet delvis i jämförelse med endast en inklippt sekvens. Framför allt så kan det bli problem när man vill testa många fler varianter än i denna studie, ju fler man testar desto större chans att hitta ett förbättrat virus. De producerade varianter kommer i fortsatta studier testas och leda till slutsatser kring hur två insättningar samtidigt kan påverka virusets transport, förhoppningsvis på ett sätt som kan användas för att bota fler genetiska sjukdomar i framtiden.

• author: Wängnerud, Linus
• supervisor: Marcus Davidsson; Christina Sakellariou
• organization: Department of Immunotechnology
• course: KIMM05 20251
• year: 2025
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Technology and Engineering
• keywords: Adeno-associated virus, capsid engineering, gene therapy, AAV
• language: English
• id: 9200930
• date added to LUP: 2025-06-27 13:55:01
• date last changed: 2025-06-27 13:55:01