Advanced

Generation and molecular characterization of recombinant scFv antibodies, microarray adapted by molecular design

Warfvinge, Cecilia LU (2016) KIM820 20152
Department of Immunotechnology
Educational programmes, LTH
Abstract
Analyses of biological samples today include protein microarray, a high-throughput technology that can be used for protein expression profiling, targeting disease related biomarkers. Affinity microarray utilises scFv antibodies, fixed in an ordered pattern on a solid support. Albeit high biocompatibility and sensitivity, this technique causes randomised antibody orientation, which could negatively influence the reactivity of the arrayed antibodies. The photo-reactive unnatural amino acid p-benzoyl-L-phenylalanine (pBpa), can be incorporated into a scFv structure using site-directed mutagenesis and a specific RNA (tRNA)/aminoacyl-tRNA synthetase pair. Through a technology known as dock ‘n’ flash, pBpa can be covalently coupled to cyclic... (More)
Analyses of biological samples today include protein microarray, a high-throughput technology that can be used for protein expression profiling, targeting disease related biomarkers. Affinity microarray utilises scFv antibodies, fixed in an ordered pattern on a solid support. Albeit high biocompatibility and sensitivity, this technique causes randomised antibody orientation, which could negatively influence the reactivity of the arrayed antibodies. The photo-reactive unnatural amino acid p-benzoyl-L-phenylalanine (pBpa), can be incorporated into a scFv structure using site-directed mutagenesis and a specific RNA (tRNA)/aminoacyl-tRNA synthetase pair. Through a technology known as dock ‘n’ flash, pBpa can be covalently coupled to cyclic carbohydrate β-cyclodextrin both in-solution and on a coated surface upon excitation to 350- 360 nm wavelength light. The technique enables predictable scFv orientation and thereby exposed binding sites, a property desirable in the development of a new microarray based platform. This master’s thesis project explored the possibility to incorporate pBpa into 10 scFv antibodies of five specificities through site-directed mutagenesis. It aimed to evaluate the antibody functionality and on-chip performance. Due to obstacles during scFv+/pBpa+ transformation, along with challenging antibody production, the project was not complete in respect to its originally planned protein evaluations. In was concluded that TOP10 competent E. coli are not appropriate hosting scFv+/pBpa+ transformation. Instead it was found that Rosetta-gami 2 and NovaBlue E. coli are suitable scFv+/pBpa+ transformation hosts, and that NovaBlue can partake in mutant scFv antibody production. These new data hopefully contribute to a possible future development of a new high-performance microarray immobilization technique. (Less)
Popular Abstract (Swedish)
Vetenskapen har gjort att vi kan idag kan känna igen ett sjukdomstillstånd, eller följa ett sjukdomsförlopp genom att titta på dess biologiska fingeravtryck. För att man ska kunna upptäcka och tolka ett sådant fingeravtryck behöver man ett högteknologiskt redskap; microarray.
Ett biologiskt fingeravtryck utgörs av en uppsättning ämnen, eller biomarkörer, som i olika kombinationer och koncentrationer blir specifika för ett hälsotillstånd. Detta kan tala om för läkare att en patient lider av exempelvis en infektion eller en sjukdom. Med teknologins hjälp vill man fånga upp biomarkörerna en och en från ett prov, och kunna säga att ”dessa biomarkörer finns, och så här många är de”. En biomarkör kan också kallas antigen, och det kan kännas... (More)
Vetenskapen har gjort att vi kan idag kan känna igen ett sjukdomstillstånd, eller följa ett sjukdomsförlopp genom att titta på dess biologiska fingeravtryck. För att man ska kunna upptäcka och tolka ett sådant fingeravtryck behöver man ett högteknologiskt redskap; microarray.
Ett biologiskt fingeravtryck utgörs av en uppsättning ämnen, eller biomarkörer, som i olika kombinationer och koncentrationer blir specifika för ett hälsotillstånd. Detta kan tala om för läkare att en patient lider av exempelvis en infektion eller en sjukdom. Med teknologins hjälp vill man fånga upp biomarkörerna en och en från ett prov, och kunna säga att ”dessa biomarkörer finns, och så här många är de”. En biomarkör kan också kallas antigen, och det kan kännas igen av en antikropp. Genom genteknik kan man utveckla antikroppar till att känna igen specifika antigen.
Med en teknik som kallas protein- microarray har man kunnat utnyttja antikropparnas igenkänningsförmåga. Antikropparna fästs på en yta och man applicerar ett prov från en patient. Ifall antikropparna finner sina antigen fångas dessa in och bildar ett komplex. Om antigenen är markerade med fluorescerande ämnen kan man se vilka antigen och antikroppar som funnit varandra, och man får ett slags fingeravtryck. Ett problem med microarray är att antikropparna kan hamna lite hur som helst på ytan där man fäster dem. Detta betyder att de kanske inte alls har möjlighet att fånga upp sina antigen, eller på annat sätt fungerar sämre. Om man kunde finna ett sätt att immobilisera antikropparna i rätt position varje gång skulle detta innebära att microarray- tekniken blev både känsligare och pålitligare.
Det här projektet byggde på en studie där man lyckats förändra antikroppar till att bära den konstgjorda aminosyran p- benzoyl-L-phenylalanine (pBpa). pBpa har förmågan att skapa kemiska bindningar
med andra ämnen om man lyser på den med en viss sorts ljus. Man lyckades koppla en del av antikroppen till en donut- liknande kolhydrat som heter β- cyclodextrin (β-CD), där β-CD fungerade som ett slags ankare. Detta kunde hålla antikroppen i rätt position på ytan, och frilägga den antigenkopplande delen. Tekniken kallas dock ’n’ flash.
Syftet med detta projekt var att undersöka möjligheten att föra in pBpa i många fler antikroppar, och se hur väl de fungerade i microarray efter dock ’n’ flash. DNA som kodar för antikropparna muterades i labbet. DNA:t fördes sedan in i E. coli-bakterier som skulle producera antikropparna med pBpa. Mutationen var möjlig att genomföra. Att föra in det nya DNA:t i bakterierna var desto svårare. Under arbetets gång gjordes många försök att övertyga de motsträviga bakterierna, som i slutändan ändå övervanns, och som en bonus tillkom många nya erfarenheter. Slutligen gjordes en prov-produktion av de muterade antikropparna, som tyvärr inte gav mycket resultat.
Trots de motgångar som projektet fick genomgå har det bidragit med en del viktiga lärdomar. Förhoppningsvis leder detta i sinom tid till högpresterande antikroppar som i dock ’n’ flash och microarray kan underlätta att finna biomarkörer. Detta kan därmed hjälpa läkare i sitt arbete för patienterna. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
Warfvinge, Cecilia LU
supervisor
organization
course
KIM820 20152
year
type
H2 - Master's Degree (Two Years)
subject
language
English
id
8892800
date added to LUP
2016-10-04 14:13:59
date last changed
2016-10-05 04:07:48
@misc{8892800,
  abstract     = {Analyses of biological samples today include protein microarray, a high-throughput technology that can be used for protein expression profiling, targeting disease related biomarkers. Affinity microarray utilises scFv antibodies, fixed in an ordered pattern on a solid support. Albeit high biocompatibility and sensitivity, this technique causes randomised antibody orientation, which could negatively influence the reactivity of the arrayed antibodies. The photo-reactive unnatural amino acid p-benzoyl-L-phenylalanine (pBpa), can be incorporated into a scFv structure using site-directed mutagenesis and a specific RNA (tRNA)/aminoacyl-tRNA synthetase pair. Through a technology known as dock ‘n’ flash, pBpa can be covalently coupled to cyclic carbohydrate β-cyclodextrin both in-solution and on a coated surface upon excitation to 350- 360 nm wavelength light. The technique enables predictable scFv orientation and thereby exposed binding sites, a property desirable in the development of a new microarray based platform. This master’s thesis project explored the possibility to incorporate pBpa into 10 scFv antibodies of five specificities through site-directed mutagenesis. It aimed to evaluate the antibody functionality and on-chip performance. Due to obstacles during scFv+/pBpa+ transformation, along with challenging antibody production, the project was not complete in respect to its originally planned protein evaluations. In was concluded that TOP10 competent E. coli are not appropriate hosting scFv+/pBpa+ transformation. Instead it was found that Rosetta-gami 2 and NovaBlue E. coli are suitable scFv+/pBpa+ transformation hosts, and that NovaBlue can partake in mutant scFv antibody production. These new data hopefully contribute to a possible future development of a new high-performance microarray immobilization technique.},
  author       = {Warfvinge, Cecilia},
  language     = {eng},
  note         = {Student Paper},
  title        = {Generation and molecular characterization of recombinant scFv antibodies, microarray adapted by molecular design},
  year         = {2016},
}