Advanced

Optimization of production of high-quality recombinant antibody fragments for use in microarray applications

Månefjord, Jesper LU and Titus, Alexander LU (2017) KIM820 20161
Department of Immunotechnology
Educational programmes, LTH
Abstract
Antibodies have proven its usefulness in a variety of technologies, including Flow Cytometry, Immunohistochemistry and Antibody Microarrays. The latter, which has been applied in e.g. biomarker discovery, disease monitoring, prognostics and protein expression profiling, has become a workhorse in affinity proteomics. By recombinantly expressing scFv antibody fragments in E. coli, a high-throughput production process could be developed to generate these microarrays. This process, including inoculation, cultivation, purification and quantification, is essential to the end-product (the array) if a high-quality setup is to be assured. In this study, the scFv antibody production process was optimized with respect to production yield, purity,... (More)
Antibodies have proven its usefulness in a variety of technologies, including Flow Cytometry, Immunohistochemistry and Antibody Microarrays. The latter, which has been applied in e.g. biomarker discovery, disease monitoring, prognostics and protein expression profiling, has become a workhorse in affinity proteomics. By recombinantly expressing scFv antibody fragments in E. coli, a high-throughput production process could be developed to generate these microarrays. This process, including inoculation, cultivation, purification and quantification, is essential to the end-product (the array) if a high-quality setup is to be assured. In this study, the scFv antibody production process was optimized with respect to production yield, purity, quantification quality, cost and time. In order to achieve this, cultivation media, media volume, cell density, purification- and quantification methods were evaluated. A previously established in-house protocol was used as starting-point and the outcome of each evaluated parameter was compared to it and thereby optimized. The protocol was used in a small-scale production-line, resulting in 300 µl of liquid sample of produced scFv antibody fragments. Two scFv antibody libraries, n-CoDeR and HelL-11/13, were used as antibody source. The results showed that the parameters affected production yield differently depending on which library we produced from. Therefore, a new protocol was designed and suggested for each of the libraries. The new protocol for n-CoDeR scFv antibodies utilized Terrific Broth as medium and was induced at a higher cell density (OD600>1.1). This setting resulted in a 10% higher production yield than standard protocol. The HelL-11/13 scFv antibodies produced a 30% higher production yield in a 2xYT-medium at normal cell density (OD600≈0.7) compared to standard protocol. Both protocols were further improved with respect to production yield by a change to a four times cheaper purification method. A new, more precise, quantification method was established which reduced measurement time by 76 minutes with respect to a 96-sample batch. (Less)
Popular Abstract (Swedish)
Effektivare antikroppsproduktion kan leda till bättre forskningsverktyg och framsteg inom antibody microarray

Antikroppen har funnit en plats inom analys av proteinsammansättningar. Forskningsverktyget antibody microarray har i det avseendet visat sig vara kraftfullt och används idag flitigt. Krav på produktionen av antikroppsfragment har således ökat, men att producera dessa har visat sig var utmanande. I denna studie har en förbättring av ett rådande produktionsprotokoll genomförts med mål att vidareutveckla antibody microarray-teknologin.
Antikroppar är molekyler som är specialiserade på att identifiera olika ämnen. Vår egen kropp använder dessa i immunförsvaret för att identifiera bakterier och andra sjukdomsorsakande ämnen som... (More)
Effektivare antikroppsproduktion kan leda till bättre forskningsverktyg och framsteg inom antibody microarray

Antikroppen har funnit en plats inom analys av proteinsammansättningar. Forskningsverktyget antibody microarray har i det avseendet visat sig vara kraftfullt och används idag flitigt. Krav på produktionen av antikroppsfragment har således ökat, men att producera dessa har visat sig var utmanande. I denna studie har en förbättring av ett rådande produktionsprotokoll genomförts med mål att vidareutveckla antibody microarray-teknologin.
Antikroppar är molekyler som är specialiserade på att identifiera olika ämnen. Vår egen kropp använder dessa i immunförsvaret för att identifiera bakterier och andra sjukdomsorsakande ämnen som behöver bekämpas. Forskare har länge utnyttjat hur bra antikropparna är på att identifiera olika ämnen och ju bättre man har blivit på att ta fram antikroppar desto fler användningsområden har tillkommit. Ett av de nyare användningsområdena, antibody microarray, består av ett chip som man fäst (immobiliserat) olika antikroppar på. På detta chip tillsätter man sedan ett prov, till exempel från blod. Analys av chippet kan då avslöja vilka ämnen som är närvarande i provet. Valet av antikroppar, gör att man kan skräddarsy vilka ämnen man vill detektera. Detta har visat sig vara användbart, bland annat för att enkelt kunna diagnostisera sjukdomar som annars kan vara svåra att upptäcka. För att analysen ska fungera bra måste antikropparna behålla sin aktivitet efter immobilisering, vilket ställer krav på produktionen av dessa. Ju renare och mer koncentrerat prov man fått fram, desto bättre analyskvalitet kan uppnås.
En typ av antikroppar som ofta används kallas scFv och kan ses som en antikropp i miniformat där bara de viktigaste delarna bibehållits. Dessa är enklare att producera från bakterier och har visat sig fungera bra på chip. Tillverkningsprocessen börjar med att man låter bakterierna dela sig tills de är många nog att på ett effektivt sätt kunna producera antikropparna. Eftersom man bara är intresserad av antikropparna, måste de skiljas från bakterierna och andra proteiner som producerats. Detta åstadkoms genom att antikropparna innehåller en så kallad his-tag som enkelt kan fångas upp ur lösningen. Mängden antikroppar som producerats och renats kan därefter bestämmas genom att mäta absorbansen av ljus vid våglängd 280 nm.
I det här projektet har vi undersökt hur antikroppsproduktionen skulle kunna förbättras. Genom att variera betingelserna under tillväxten av bakterierna kunde vi avgöra vilka som genererade flest antikroppar. Tillväxtmedium, volym av medium och celldensitet vid inducering justerades till optimal nivå. Olika uppreningsmetoder testades därefter och en metod som både gav fler antikroppar och var billigast kunde fastslås. Slutligen utvärderades även olika metoder för att mäta mängden antikroppar. Där valdes en metod som både bidrog till att höja precisionen av mätningarna men även att reducera tidsåtgången markant eftersom 96 prover parallellt kunde avläsas.
Sammanfattningsvis så ledde vår undersökning till att hitta en tillverkningsprocess för antikroppar som var mindre tidskrävande, gav mer antikroppar och även mer precis mätdata. Denna förbättring kan i förlängningen leda till mer högkvalitativa och billigare antibody microarrays, vilket är ett av stegen för att utveckla tekniken vidare. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
Månefjord, Jesper LU and Titus, Alexander LU
supervisor
organization
course
KIM820 20161
year
type
H2 - Master's Degree (Two Years)
subject
keywords
Immunotechnology, Antibody microarray, ScFv, Optimization, Protein production, E.coli, Protein purification, Protein quantification
language
English
additional info
Authors Jesper Månefjord and Alexander Titus contributed equally to the report and the work described in it.
id
8905183
date added to LUP
2017-05-15 10:33:32
date last changed
2017-05-15 10:33:32
@misc{8905183,
  abstract     = {Antibodies have proven its usefulness in a variety of technologies, including Flow Cytometry, Immunohistochemistry and Antibody Microarrays. The latter, which has been applied in e.g. biomarker discovery, disease monitoring, prognostics and protein expression profiling, has become a workhorse in affinity proteomics. By recombinantly expressing scFv antibody fragments in E. coli, a high-throughput production process could be developed to generate these microarrays. This process, including inoculation, cultivation, purification and quantification, is essential to the end-product (the array) if a high-quality setup is to be assured. In this study, the scFv antibody production process was optimized with respect to production yield, purity, quantification quality, cost and time. In order to achieve this, cultivation media, media volume, cell density, purification- and quantification methods were evaluated. A previously established in-house protocol was used as starting-point and the outcome of each evaluated parameter was compared to it and thereby optimized. The protocol was used in a small-scale production-line, resulting in 300 µl of liquid sample of produced scFv antibody fragments. Two scFv antibody libraries, n-CoDeR and HelL-11/13, were used as antibody source. The results showed that the parameters affected production yield differently depending on which library we produced from. Therefore, a new protocol was designed and suggested for each of the libraries. The new protocol for n-CoDeR scFv antibodies utilized Terrific Broth as medium and was induced at a higher cell density (OD600>1.1). This setting resulted in a 10% higher production yield than standard protocol. The HelL-11/13 scFv antibodies produced a 30% higher production yield in a 2xYT-medium at normal cell density (OD600≈0.7) compared to standard protocol. Both protocols were further improved with respect to production yield by a change to a four times cheaper purification method. A new, more precise, quantification method was established which reduced measurement time by 76 minutes with respect to a 96-sample batch.},
  author       = {Månefjord, Jesper and Titus, Alexander},
  keyword      = {Immunotechnology,Antibody microarray,ScFv,Optimization,Protein production,E.coli,Protein purification,Protein quantification},
  language     = {eng},
  note         = {Student Paper},
  title        = {Optimization of production of high-quality recombinant antibody fragments for use in microarray applications},
  year         = {2017},
}