Construction of a Novel miRNA Library Preparation kit for Next Generation Sequencing

Abstract

MicroRNAs are small single stranded RNA molecules containing approximately 22 nucleotides and these play an important regulatory role in gene expression. MicroRNAs are found to be involved in several diseases and knowledge about their sequences can be an important tool in the foundation of novel treatment methods against diseases. Today, these small RNA molecules are mainly analyzed with qPCR and microarray, which are both limited to analyze already known miRNAs. Next Generation Sequencing is a sensitive technique that will enable the identification of not already known sequences of miRNA. There are existing kits for the use of Next Generations Sequencing on miRNA, however, these protocols remain tedious and inefficient due to the short length of miRNAs. To be able to analyze the nucleotides with Next Generation Sequencing, adapters were needed to be ligated to the ends of the nucleotides to be able to bind to the flow cell on the instrument as well as to introduce sequencing primer binding sites to the construct. To increase the efficiency and improve the user friendliness of the existing kits, an enhancing molecule was in this project utilized to act as a starting material of a novel kit for library preparation for Next Generation Sequencing.
The method was in this project optimized to produce the correct product with a high yield and purity. Several different parameters were considered and in the end, the correct product was produced, meaning that the outcome was successful.
Techniques included in this master thesis projects were ligation, reverse transcription, qPCR and capillary electrophoresis. Techniques that were outsourced included Sanger Sequencing and cloning into a vector for more reliable sequencing results from the Sanger Sequencing method. Synthesis of oligonucleotides used in the construct were also outsourced.
The long-term goal with this project is to deliver a new product to the market. However, to succeed with this, the method needs to be optimized for real RNA samples and the technique needs to be compared with existing techniques. The final library then needs to be run on a Next Generation Sequencing instrument to generate proof of principle data.

Popular Abstract (Swedish)

MicroRNAs (miRNAs) är små, enkelsträngade RNA molekyler som består av cirka 22 molekylära byggstenar, nukleotider. Nukleotiderna består antingen av adenin (A), guanin (G), cytosin (C) eller uracil (U). Dessa små RNA molekyler är involverade i flertalet sjukdomar och genom att hitta sekvensen av dessa A, G, C, T i ett biologiskt prov, kan miRNAt agera som markör för att hitta nya behandlingsmetoder för sjukdomar. Idag analyseras miRNAs genom två olika tekniker, antingen qPCR eller microarray. Båda dessa är dock begränsade till att identifiera redan kända miRNAs. Nästa generations sekvensering, NGS, är en känslig teknik som kan identifiera miRNAs med sekvenser som idag är okända. För att de ska kunna analyseras med hjälp av NGS måste de först förberedas till ett så kallat bibliotek. Det finns idag ett antal kit för att göra detta, dock har de låg effektivitet och omständiga protokoll.
För att analysera nukleotiderna med NGS måste adaptersekvenser ligeras (klistras på) till ändarna av miRNAt. Dessa adaptrar används sedan för att binda till en flödescell i NGS instrumentet och för att vara en startregion för sekvenseringen. I existerande kits ligeras dessa med något som kallas ”blunt-end ligation”, det vill säga två trubbiga ändar klistras samman, utan något överlapp. Denna typ av ligering är känd att ha låg effektivitet. För att öka effektiviteten och förbättra användarvänligheten av de existerande kiten, har en molekyl (X och Y) i denna studie utvecklats, som ska läggas till för att förbättra ligeringen.
Tekniken med denna ”förbättringsmolekyl” optimerades för att producera rätt produkt med ett högt utbyte och renhet. Flera olika parametrar ändrades och i slutet genererades rätt produkt, med miRNAt ligerat till adaptrarna på varsin sida. Detta bekräftades genom att använda två olika restriktionsenzym, som båda klipper i en sekvens som är specifik för miRNAt samt att den ihopklistrade produkten var av förväntad storlek.
Det första steget i utförandedelen var att hitta sekvenserna för de adaptrar som skulle klistras på. Dessa adaptersekvenser skulle vara kompatibla med Illuminas (ledande aktören inom NGS) instrument, eftersom det är instrumentet miRNA provet ska förberedas för att användas på. När sekvenserna var bestämda beställdes de, tillsammans med ett miRNa, som syntetiserades av ett annat företag.
När de syntetiserade nukleotiderna anlände, började det laborativa arbetet, där adaptrarna först blandades med molekyl X eller Y. Efter detta följdes ligeringen av miRNAt. Efter adaptrarna klistrats på till sidorna av miRNAt behövde produkten göras om till DNA, för att vara kompatibel med NGS instrumentet. Detta gjordes genom en andra enzymatisk reaktion, revers transkription. Det sista steget för bibliotekspreparation var att amplifiera DNA produkten och analysera dess startkoncentration. Detta gjordes med qPCR, där en fluorescerande signal ökar med ökad DNA produkt i reaktionen. Kapillär elektrofores är en teknik som används för att analysera storleken på RNA/DNA fragment och det användes i detta projekt i flera steg för att undersöka hur ligeringen resulterade efter de olika stegen.
Parametrarna som ändrades i de olika stegen kan ses i figur 1 nedan. I det första steget ändrades förhållandet mellan adaptrar och molekyl X/Y för att se om det gav någon skillnad på resultaten. Adaptrarna syntetiserades också som DNA för att se om det kunde ge bättre resultat, då DNA är mer stabilt än RNA. I det andra steget, ligeringen, testades olika tider, temperaturer, mängd miRNA och adaptrar+molekyl X/Y tillsatt till reaktionen, samt mängden ligas, vilket är enzymet som skyndar på ligeringen. I det tredje steget, revers transkription, testades olika tider, mängden ligeringsprodukt tillsatt samt två olika enzym som antingen har eller saknar RnaseH aktivitet (degraderar RNAt efter bildningen av DNA). I qPCR-steget testades två olika master mixar med olika mängd enzym, antalet amplifieringscykler, mängden RT produkt tillagt samt temperaturen.

Figur 1. Visar de olika parametrarna som ändrades i de olika stegen i metoden.
Den viktigaste parametern visade sig vara mängden ligeringsprodukt som lades till reverse transkriptionssteget. När maximal mängd tillsattes genererades rätt produkt, medan det blev fel produkt när minimal mängd tillsattes. Det visade sig också vara bättre att ligera vid 37 ⁰C än vid rumstemperatur när rätt produkt skapades. Tiden spelade inte så stor roll, och eftersom ett enkelt protokoll var önskat, valdes 15 minuter till den mest optimala. Tekniken genererade även mer av rätt produkt då mängden inmatningsmaterial till ligeringen var maximal. Tiden i reverse transkription visade sig vara lika bra vid 30 min som 45 min, varför det valdes att gå vidare med 30 min. RnaseH aktivitet gav sämre resultat än med det enzym som saknade detta.
Det långsiktiga målet med detta projekt är att leverera en ny produkt, ett nytt bibliotekspreparationskit för miRNA för NGS, till marknaden och för att lyckas med detta behövs mer arbete göras. Metoden måste bli optimerad för riktiga RNA prover, i detta projekt använde endast syntetiserade RNA, och tekniken måste jämföras med existerande metoder. Det slutgiltiga biblioteket måste sedan köras på ett NGS instrument för att få data som bevisar att det fungerar.

• author: Klemedtsson Elerud, Viktoria
• supervisor: Christer Wingren; Robert Sjöback
• organization: Department of Immunotechnology; Educational programmes, LTH
• course: KIM820 20171
• year: 2017
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Biology and Life Sciences
• language: English
• id: 8919709
• date added to LUP: 2017-06-29 11:38:54
• date last changed: 2017-06-29 11:38:54