Functional investigations of SPI-B and dCK in relation to cytarabine resistance in MCL

Abstract

Mantle cell lymphoma (MCL) is an aggressive type of B-cell lymphoma with poor clinical outcome. The use of cytarabine (ara-C, cytosine analogue), a chemotherapeutic drug, in the treatment of MCL, has during the last decade greatly improved the survival rate in younger patients, but relapses are common and are often associated with drug resistance and poor outcome. The origin if resistance development is still unknown, but it is a major clinical problem and thus understanding the biological mechanisms behind the resistance is of great interest. In this project two proteins, dCK and SPI-B, with recently suggested connection to cytarabine resistance will be further studied. DCK is involved in the phosphorylation of cytarabine inside the cell to activate the prodrug, and downregulation of the protein has been reported in cytarabine resistant MCL cell models. SPI-B is a transcription factor involved in the activation of nuclear factor (NF)-ĸB pathway and our research group have previously shown an upregulation of SPI-B in cytarabine resistant cells. This study aims to further understand the relevance and the relation of these two proteins in cytarabine resistance. We used transfection of siRNA/plasmids to knockdown SPI-B and to re-introduce dCK in the cytarabine resistant MCL cell line Z138 sub clones, previously established in a project at the department of Immunotechnology. Western blotting and qPCR were used to confirm and determine the transfection efficiency. Proliferation in cytarabine containing media of the transfected clones were assessed and both re-introduction of dCK and knockdown of SPI-B partly restored the sensitivity towards cytarabine, indicating that both proteins have important impact on cytarabine resistance development. The link between expression of dCK and SPI-B up- and downregulation was further confirmed as SPI-B levels were altered as a response to re-introduction of dCK.

Popular Abstract (Swedish)

Mantelcellslymfom är en typ av cancer som drabbar B-celler, en typ av vita blodkroppar som är viktiga för kroppens immunförsvar. Sjukdomen är obotlig och många patienter överlever endast tre till fyra år efter diagnostisering. Ett läkemedel som har ökat livslängden hos framförallt unga patienter med mantelcellslymfom är cytarabin. Behandling med cytarabin leder tyvärr också ofta till att patienterna blir resistenta mot läkemedlet och då är återfall vanligt. Orsaken till att patienterna utvecklar en resistens mot cytarabin är idag okänd, men eftersom att läkemedlet är en viktig del av behandlingen av mantelcellslymfom är det viktigt att ta reda på varför. I det här projektet studeras två proteiner som visat sig ha betydelse för cytarabin-resistens i en cellmodell; SPI-B och deoxycytidin kinas (dCK). Dessa proteiner har i tidigare forskning visats vara involverade i uppkomsten av resistens, men det är ännu oklart på vilket sätt. SPI-B har visats vara uppreglerat i resistenta celler, medan uttrycket av dCK försvinner helt. För att närmare undersöka dessa proteiner användes en cytarabin-resistent cellmodell, utvecklad från mantelcellslymfomceller. I det här projektet ville vi se hur SPI-B och dCK påverkade proliferationen (förmågan att växa) hos de cytarabin-resistenta cellerna. Detta gjordes i två utföranden; i det första tystades SPI-B-proteinet och i det andra återinfördes uttrycket av dCK. Båda utföranden genomfördes genom transfektion, en metod som tillåter introduktion av nytt genmaterial till celler. För att kontrollera hur väl transfektionen fungerade studerades resultatet på gen-och proteinnivå för tystandet av SPI-B och på proteinnivå för återinförandet av dCK. Detta visade att ungefär 50% av SPI-B-proteinet minskade i cytarabinresistenta celler efter tystande av SPI-B och att dCK återinfördes till samma nivå som i de mantelcellslymfomceller som inte är resistenta mot cytarabin. Proliferationsstudien gjordes genom att studera hur cellerna växte i medium som innehöll olika koncentrationer av cytarabin under 72 timmar, efter tystandet av SPI-B och återinförandet av dCK. Det visade sig att de cytarabin-resistenta cellerna blir känsligare mot cytarabin igen och delvis, men inte helt, förlorar förmågan att växa när SPI-B-proteinet tystades och dCK-proteinet återinfördes. Vi undersökte även om SPI-B och dCK påverkar varandra i cytarabin-resistenta celler. Det visade sig att uttrycket av SPI-B minskade i celler där dCK-proteinet var återinfört. Dessa resultat betyder att både återinförandet av dCK och tystandet av SPI-B kan göra cellerna känsliga mot cytarabin igen, men att endast reglering av dessa proteiner inte räcker för att cytarabin ska fungera tillräckligt bra igen. Det pågår flera studier som undersöker dessa protein ytterligare, till exempel om det är möjligt att förhindra att dCK försvinner. Det vore även intressant att undersöka andra proteiner som kan vara involverade i uppkomsten av cytarabinresistens. Relationen mellan dCK och SPI-B och hur denna påverkar mantelcellslymfomceller och cytarabin-resistens behöver också undersökas ytterligare, då det inte verkar vara en direkt koppling mellan de två proteinerna utan att dCK påverkar SPI-B indirekt.

• author: Karlsson, Ellinor
• supervisor: Sara Ek; Catja Freiburghaus
• organization: Department of Immunotechnology; Educational programmes, LTH
• course: KIM820 20171
• year: 2017
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Biology and Life Sciences
• language: English
• id: 8920183
• date added to LUP: 2017-06-30 15:19:46
• date last changed: 2017-06-30 15:19:46