Skip to main content

LUP Student Papers

LUND UNIVERSITY LIBRARIES

Development of a purification process for Protease X and implementation of an immobilized enzyme reactor

Rosman, Frida LU (2018) KBKM05 20181
Pure and Applied Biochemistry
Computational Chemistry
Abstract
Downstream processing is an essential part in the production of biomolecules and the optimization of these processes are of great value, since they can be both time consuming and expensive. One common type of enzyme used in different biotechnical approaches is proteases and in this study Protease X was investigated. In order to use the enzyme in a process, a purification procedure needs to be established and in this case, it was followed by immobilization of the purified enzyme. Two different purification approaches were used, immobilized metal affinity chromatography (IMAC) and ion-exchange (IEX). The IMAC was performed with three different buffers in the second wash step and the variant with the highest yield, 50% was a buffer with 30%... (More)
Downstream processing is an essential part in the production of biomolecules and the optimization of these processes are of great value, since they can be both time consuming and expensive. One common type of enzyme used in different biotechnical approaches is proteases and in this study Protease X was investigated. In order to use the enzyme in a process, a purification procedure needs to be established and in this case, it was followed by immobilization of the purified enzyme. Two different purification approaches were used, immobilized metal affinity chromatography (IMAC) and ion-exchange (IEX). The IMAC was performed with three different buffers in the second wash step and the variant with the highest yield, 50% was a buffer with 30% isopropanol. The purification step with IEX was performed with several buffers with different salt concentrations at pH 5 and pH 7. The buffer with the best separation and highest yield of 22% contained no NaCl and had a pH of 5. Due to the low yields, both purification steps need to be further optimized to achieve an economically viable downstream process. The immobilization was based on amine coupling and performed in spherical porous particles with a coupling efficiency of approximately 100%. The most suitable storage buffer to retain the activity of the immobilized enzymes was 0.01% NaN3 in 1x PBS. However, the operational effectiveness of the immobilized column was only 5% compared to the enzyme in solution and the cleavage time was over 20 times longer. Thus, from the knowledge of the enzyme right now it would be more suitable and efficient to have a process consisting of a reactor with free enzyme. (Less)
Popular Abstract (Swedish)
Biomolekyler, så som proteiner, produceras genom att DNA som kodar för dessa molekyler tillsätts i celler. Cellerna kan exempelvis vara bakterier, jäst eller från däggdjur. Dessa celler producerar inte enbart de önskade proteinerna utan även andra proteiner som är nödvändiga för att cellerna ska kunna överleva. Som en följd av detta är upprening en av de viktigaste processerna i produktionen av proteiner för att isolera den önskade produkten från andra orenheter. Renhetsgraden efter uppreningsprocessen varierar beroende på ändamålet. Om proteinet ska användas i läkemedel ställs höga krav på renheten då föroreningar kan vara direkt skadligt för patienterna medan för andra applikationer så som till exempel för framställning av kemikalier är... (More)
Biomolekyler, så som proteiner, produceras genom att DNA som kodar för dessa molekyler tillsätts i celler. Cellerna kan exempelvis vara bakterier, jäst eller från däggdjur. Dessa celler producerar inte enbart de önskade proteinerna utan även andra proteiner som är nödvändiga för att cellerna ska kunna överleva. Som en följd av detta är upprening en av de viktigaste processerna i produktionen av proteiner för att isolera den önskade produkten från andra orenheter. Renhetsgraden efter uppreningsprocessen varierar beroende på ändamålet. Om proteinet ska användas i läkemedel ställs höga krav på renheten då föroreningar kan vara direkt skadligt för patienterna medan för andra applikationer så som till exempel för framställning av kemikalier är det inte lika höga krav på slutprodukten. Då olika proteiner har olika egenskaper och utseende är det vanligt att flera metoder används i en uppreningsprocess för att nå den önskade renhetsgraden. Flera proteiner kan ha liknande egenskaper vilket kan göra separationen komplicerad. Proteinerna kan exempelvis separeras baserat på deras laddning, storlek eller särskild affinitet för andra molekyler eller joner. En vanlig metod är vätskekromatografi, vilket består av en rad olika sorters varianter där affinitetskromatografi och jonbyteskromatografi frekvent används vid just proteinupprening. Det är av stort intresse att optimera uppreningsprocessen, då den kan bli väldigt dyr och ibland motsvara upp till 80 % av hela produktionskostnaden samt att den är tidskrävande med flera olika steg.
I den här studien utvecklades en uppreningsprocess av ett protein, Proteas X bestående av två kromatografisteg. Dessa var just affinitetskromatografi och jonbyteskromatografi som nämnts tidigare. Kromatografistegen testades med buffertar innehållandes olika komponenter och pH för att få en så bra separation som möjligt men samtidigt behålla aktiviteten och stabiliteten av proteinet. Slutresultatet blev ett utbyte på 50 % och 20 % i de två stegen vilket kan anses vara lågt. Fler olika variationer av buffertar skulle vara intressant att testa för att öka mängden upprenat protein samt att eventuellt lägga till ett extra reningssteg för att ytterligare få bort oönskade proteiner. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
Rosman, Frida LU
supervisor
organization
course
KBKM05 20181
year
type
H2 - Master's Degree (Two Years)
subject
keywords
downstream processes, enzyme immobilization, biotechnology, applied biochemistry
language
English
id
8963490
date added to LUP
2022-06-30 10:51:55
date last changed
2022-06-30 10:51:55
@misc{8963490,
  abstract     = {{Downstream processing is an essential part in the production of biomolecules and the optimization of these processes are of great value, since they can be both time consuming and expensive. One common type of enzyme used in different biotechnical approaches is proteases and in this study Protease X was investigated. In order to use the enzyme in a process, a purification procedure needs to be established and in this case, it was followed by immobilization of the purified enzyme. Two different purification approaches were used, immobilized metal affinity chromatography (IMAC) and ion-exchange (IEX). The IMAC was performed with three different buffers in the second wash step and the variant with the highest yield, 50% was a buffer with 30% isopropanol. The purification step with IEX was performed with several buffers with different salt concentrations at pH 5 and pH 7. The buffer with the best separation and highest yield of 22% contained no NaCl and had a pH of 5. Due to the low yields, both purification steps need to be further optimized to achieve an economically viable downstream process. The immobilization was based on amine coupling and performed in spherical porous particles with a coupling efficiency of approximately 100%. The most suitable storage buffer to retain the activity of the immobilized enzymes was 0.01% NaN3 in 1x PBS. However, the operational effectiveness of the immobilized column was only 5% compared to the enzyme in solution and the cleavage time was over 20 times longer. Thus, from the knowledge of the enzyme right now it would be more suitable and efficient to have a process consisting of a reactor with free enzyme.}},
  author       = {{Rosman, Frida}},
  language     = {{eng}},
  note         = {{Student Paper}},
  title        = {{Development of a purification process for Protease X and implementation of an immobilized enzyme reactor}},
  year         = {{2018}},
}