Recombinant Expression of Novel Wild Type Oat Hemoglobins in Escherichia Coli

Abstract

Hemoglobin is a protein transporting oxygen through our bloodstreams and is as such essential for aerobic life. Hemoglobins also exist in plants, with a wide variety of functions other than oxygen transport. The study of plant hemoglobins could potentially be interesting for the development of synthetic blood substitutes and have also shown promise as an alternative dietary source of the more bioavailable heme-iron, other than conventional meat. Oat has recently been sequenced, which has allowed insight into its inner proteomic workings. In this master thesis, three novel hemoglobins were identified in the oat genome, transformed into Escherichia coli and recombinantly expressed. The project aimed to maximize the recombinant production of these hemoglobins. A high cell density and the addition of a heme-precursor (δ-ALA) were identified as key parameters for effective expression. Analysis by SDS-PAGE of the proteins produced by E. coli failed to unambiguously identify the sought after hemoglobins following expression, however, transcriptomic analysis by RT-qPCR confirmed oat-hemoglobin transcription. These results suggest that the folding of the target proteins was sub-optimal, resulting in unsatisfactory production of the proteins of interest. More work is needed to elucidate why these oat hemoglobins failed to fold properly and if they hold any promise for relevant applications using other methodology or a different recombinant host. This project also confirmed an upregulation (16-fold) of the key heme biosynthesis gene (hemH) upon successful expression of a sugar beet hemoglobin in E. coli.

Popular Abstract (Swedish)

Hemoglobin från växtriket: en lösning på blod- och järnbrist i samhället?

Många känner till hemoglobin som det protein som ger vårt blod dess röda färg och som håller oss vid liv genom att transportera syre till våra celler. Mindre känt är att nästintill alla organismer har gener i sitt DNA som kodar för liknande proteiner, även om de inte tar formen av blod så som vi är vana vid. I det här projektet har tre nya hemoglobiner identifierats i havres DNA. De har sedan uttryckts och producerats i bakterier med hjälp av genteknik.

I vardagen påminns vi ofta om att det råder blodbrist i samhället, och privatpersoner uppmanas donera sitt blod. I trauma-situationer, vid operationer och vid uppvisad blodbrist, ges idag donerat blod till patienter. Det är ett system som fungerar, men som också har många svagheter. Ett av de största problemen idag är bristen på donatorer. En annan att blod är en färskvara och måste förvaras på specifika sätt. Att individer har olika blodgrupper nödvändiggör också en större beredskap. I de områden med allra störst behov, som i krigs- och katastrofområden, är det som mest komplicerat att lösa de här problemen. Ett syntetiskt alternativ till donerat blod skulle kunna vara en lösning på många av dessa utmaningar. Idag produceras redan komplexa proteinläkemedel mot ett flertal svårbehandlade sjukdomar. Varför skulle vi inte också kunna producera konstgjort blod så länge vi hittar rätt protein? Skulle det rätta proteinet, eller hemoglobinet i det här fallet, kunna finnas gömt i just havre-växtens DNA?

Ett annat utbrett samhällsproblem idag är järnbristanemi, blodbrist som orsakas av för lågt intag av järn. Järnbristanemi behandlas ofta med järntabletter, som kan ge biverkningar så som kräkningar, diarré och förstoppning. Riskgrupper för järnbristanemi är främst kvinnor som har mens eller ammar, gravida, och individer som äter vegetarisk eller vegansk kost. Det järn som finns i vegetarisk kost är mindre tillgängligt för upptag i kroppen i jämförelse med det järn som vi hittar i animaliska produkter och som existerar bundet till hemoglobin. En möjlig lösning på järnbristproblemet är ”Impossible Foods”, helt säkra, vegetariska produkter innehållande hemoglobin som framställts med hjälp av genteknik i mikroorganismer. Det är produkter som efterliknar köttprodukter i smak, men som också innehåller det mer tillgängliga järnet som många vegetarianer saknar i sin vanliga kost. Havre är en växt som nyligen fått mycket god publicitet för sina hälsofrämjande egenskaper och är den störst växande grödan i marknaden för växtbaserade drycker. Havre är därmed en mycket intressant kandidat för nya produkter rent marknadsekonomiskt.

Havres genom, dess DNA, är ytterst komplext och har först nyligen sekvenserats. Det här har möjliggjort vidare studier av havres proteiner. Det här projektet syftade till att optimera produktionen av de tre havre-hemoglobiner som identifierats i havres genom. Under arbetets gång visade det sig att det här var svårt. Frågan kvarstår fortfarande om det, med absolut säkert, är fungerade hemoglobiner som producerats i det här projektet. De gentekniska metoder som använts i det här fallet, kloning och transformering, har validerats i flera steg. Havre-generna finns på plats i bakterien, och experiment har påvisat att bakterien läser av den anvisade genetiska koden. De resulterande cellerna uppvisade dock bara en rosa färg och inte den blodröda färg som en effektiv hemoglobin-produktion hade gett upphov till. Mer arbete är nödvändigt innan dessa hemoglobiner är redo för att användas i vidare applikationer.

• author: Rummukainen, Frank
• supervisor: Simon Christensen; Leonard Groth
• organization: Pure and Applied Biochemistry; Computational Chemistry
• alternative title: Rekombinant Produktion av Nya Vildtyp Havre-Hemoglobiner i Escherichia coli
• course: KBKM05 20221
• year: 2022
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Biology and Life Sciences
• keywords: Recombinant technology, Protein expression, Hemoglobin, Phytoglobin, Escherichia coli, Oat, Avena sativa, Heme, Iron, Biosynthesis, Transcription, qPCR, SDS-PAGE, Fermentation, Recombination, Applied Biochemistry
• language: English
• id: 9098118
• date added to LUP: 2022-08-30 15:43:45
• date last changed: 2022-08-30 15:43:45