Skip to main content

LUP Student Papers

LUND UNIVERSITY LIBRARIES

NMR assignment of PPARγ complexed with rosiglitazone using manual and automatic assignment tools

Blomskog, Elsa LU (2025) KFKM05 20251
Biophysical Chemistry
Abstract
The ligand-binding domain (LBD) of PPARγ was studied in complex with
the full agonist rosiglitazone in double- and triple-resonance NMR spectrom-
etry experiments. The long-term aim was to better understand the structure
and dynamics of the complex, and therefore how the transcription factor func-
tions in vivo. The protein LBD was expressed in E. coli and complexed with
rosiglitazone, and backbone and side chain NMR experiments were performed.
Assignment of the protein backbone was attempted with a conventional as-
signment approach using CCPN Analysis Assign, but was inconclusive. Auto-
matic backbone assignment using the web-based assignment tool I-PINE was
therefore attempted, with the idea that this could be used as a... (More)
The ligand-binding domain (LBD) of PPARγ was studied in complex with
the full agonist rosiglitazone in double- and triple-resonance NMR spectrom-
etry experiments. The long-term aim was to better understand the structure
and dynamics of the complex, and therefore how the transcription factor func-
tions in vivo. The protein LBD was expressed in E. coli and complexed with
rosiglitazone, and backbone and side chain NMR experiments were performed.
Assignment of the protein backbone was attempted with a conventional as-
signment approach using CCPN Analysis Assign, but was inconclusive. Auto-
matic backbone assignment using the web-based assignment tool I-PINE was
therefore attempted, with the idea that this could be used as a starting point
for continued assignment. The automatic assignment results were compared
to a previously published assignment of the same complex, to evaluate the
reliability and usefulness of this tool.
The I-PINE output claimed to be able to assign over 50% of the protein
with very high accuracy, but investigating the results in more detail revealed
that the assignment had large flaws. It is likely that the quality of the input
data and processing prior to automatic assignment is of great importance for
the results. The tool clearly does not manage to assign both atoms and residues
accurately, and especially seems to struggle with unexpected spectral features
such as missing or overlapping peaks. The conclusion is that I-PINE should be
used with caution, and that it most likely benefits from more input data and
more thorough pre-processing and cleaning of the spectra prior to assignment. (Less)
Popular Abstract (Swedish)
En majoritet av alla funktioner i en organism eller enskild cell är helt och
hållet beroende av proteiner, som i sin tur produceras enligt de gener som
finns i cellernas DNA - proteiner är produkten av så kallat genuttryck. Alla
gener kan dock omöjligt uttryckas samtidigt: att kunna reglera genuttrycket
är helt nödvändigt för att vi ska kunna reagera och anpassa oss efter om-
givningen, växa, utvecklas och åldras, samt för att olika vävnader ska kunna
ha specifika egenskaper. En del i denna reglering är så kallade transkrip-
tionsfaktorer. Dessa kan på olika sätt binda till DNA och antingen förhindra
eller underlätta transkriptionen till mRNA (eng. messenger RNA), det första
steget i tillverkningen av protein.

Proteinet PPARγ... (More)
En majoritet av alla funktioner i en organism eller enskild cell är helt och
hållet beroende av proteiner, som i sin tur produceras enligt de gener som
finns i cellernas DNA - proteiner är produkten av så kallat genuttryck. Alla
gener kan dock omöjligt uttryckas samtidigt: att kunna reglera genuttrycket
är helt nödvändigt för att vi ska kunna reagera och anpassa oss efter om-
givningen, växa, utvecklas och åldras, samt för att olika vävnader ska kunna
ha specifika egenskaper. En del i denna reglering är så kallade transkrip-
tionsfaktorer. Dessa kan på olika sätt binda till DNA och antingen förhindra
eller underlätta transkriptionen till mRNA (eng. messenger RNA), det första
steget i tillverkningen av protein.

Proteinet PPARγ är ett exempel på en sådan transkriptionsfaktor, och
finns i synnerhet i fettvävnad samt i immunförsvarets celler. Forskning har in-
dikerat att det finns kopplingar mellan mutationer samt förändringar i PPARγ-
aktivitet och sjukdomar så som fetma och diabetes typ 2. PPARγ är därför
intressant att studera som möjligt mål för nya läkemedel mot dessa sjukdomar.
Mekanismen för hur PPARγ reglerar genuttryck är i stor utsträckning styrd
av bindning till mindre molekyler (ligander), men exakt hur detta fungerar är
inte helt klarlagt.
I detta projekt studerades den ligandbindande delen hos PPARγ bunden
till liganden rosiglitason med hj¨alp av NMR-spektroskopi (eng. Nuclear Mag-
netic Resonance). Denna metod utnyttjar magnetiskt moment i proteinets
atomkärnor för att studera rörelser och interaktioner i proteinet med hög
upplösning. Atomkärnornas magnetiska moment riktas först längs med ett
starkt statiskt magnetfält, men roteras sedan under kort tid vinkelrätt ner i
planet av ett annat fält. Då momentet rör sig tillbaka mot ursprungsläget,
riktat längs med det första magnetfältet, induceras en mätbar ström. Sig-
nalerna som detekteras får olika frekvens beroende på vilket atomslag samt
den kemiska omgivningen hos atomen som ger upphov till signalen. Detta gör
det möjligt att undersöka hur olika atomer och därmed delar i proteinet inter-
agerar med varandra, samt hur strukturen förändras under olika förhållanden.
Huvuddelen av detta projekt bestod i att försöka tilldela toppar i NMR-
spektra till aminosyror i PPARγ-rosiglitasonkomplexet, för att sedan kunna
studera dynamiken hos olika delar av proteinet. Detta visade sig vara svårare
än förväntat, vilket föranledde att ett verktyg för automatisk tilldelning prövades
(I-PINE). En ytterligare del i projektet blev därför att jämföra resultaten när
detta verktyg användes med de som fås med konventionell tilldelning. Idén
var att verktyget I-PINE skulle kunna användas som ett första steg i tilldel-
ningsprocessen, för att underlätta och snabba på processen. I detta fall visade
det sig dock att tilldelningen inte var särskilt pålitlig. För att verktyget ska
kunna användas över huvud taget krävs med stor sannolikhet att datan håller
väldigt hög kvalitet och inte innehåller särskilt mycket avvikelser, eller att
den förarbetas mycket noga. Ett verktyg som I-PINE, som automatiskt kan
utföra analys som tar mycket lång tid att utföra manuellt skulle dock vara
av väldigt stort värde för all forskning och analyser där NMR används som
metod, förutsatt att det fungerar. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
Blomskog, Elsa LU
supervisor
organization
course
KFKM05 20251
year
type
H3 - Professional qualifications (4 Years - )
subject
keywords
biophysical chemistry, nuclear magnetic resonance, NMR, peroxisome proliferator-receptor gamma, I-PINE automated assignment
language
English
id
9203750
date added to LUP
2025-06-23 12:54:52
date last changed
2025-06-23 12:54:52
@misc{9203750,
  abstract     = {{The ligand-binding domain (LBD) of PPARγ was studied in complex with
the full agonist rosiglitazone in double- and triple-resonance NMR spectrom-
etry experiments. The long-term aim was to better understand the structure
and dynamics of the complex, and therefore how the transcription factor func-
tions in vivo. The protein LBD was expressed in E. coli and complexed with
rosiglitazone, and backbone and side chain NMR experiments were performed.
Assignment of the protein backbone was attempted with a conventional as-
signment approach using CCPN Analysis Assign, but was inconclusive. Auto-
matic backbone assignment using the web-based assignment tool I-PINE was
therefore attempted, with the idea that this could be used as a starting point
for continued assignment. The automatic assignment results were compared
to a previously published assignment of the same complex, to evaluate the
reliability and usefulness of this tool.
The I-PINE output claimed to be able to assign over 50% of the protein
with very high accuracy, but investigating the results in more detail revealed
that the assignment had large flaws. It is likely that the quality of the input
data and processing prior to automatic assignment is of great importance for
the results. The tool clearly does not manage to assign both atoms and residues
accurately, and especially seems to struggle with unexpected spectral features
such as missing or overlapping peaks. The conclusion is that I-PINE should be
used with caution, and that it most likely benefits from more input data and
more thorough pre-processing and cleaning of the spectra prior to assignment.}},
  author       = {{Blomskog, Elsa}},
  language     = {{eng}},
  note         = {{Student Paper}},
  title        = {{NMR assignment of PPARγ complexed with rosiglitazone using manual and automatic assignment tools}},
  year         = {{2025}},
}