Role of the Ser/Thr protein kinase AfsK in Streptomyces venezuelae

Abstract

Streptomycetes grow as filamentous cells called hyphae. These cells elongate using a polar method of growth where the cell wall synthesis is restricted to the hyphal tips. It has been proved that the protein DivIVA directs the cell wall assembly to the poles and initiate branch formation along the lateral cell wall. Observations of DivIVA shows that it is regulated by AfsK, a Ser/Thr protein kinase, and SppA, a protein phosphatase, in Streptomyces coelicolor. The activity of these regulatory proteins appears to influence the emerging of branches and colony phenotype. This project aimed to clarify the role of AfsK and SppA in Streptomyces venezuelae by studying the phenotypes of knockout mutants regarding their ability to phosphorylate DivIVA.

The phosphorylation of DivIVA could be studied for the ΔafsK and ΔsppA strains using Western blot. The ΔafsK strains which had been complemented with afsK, that was regulated by either the native or the kasOp* promoter, were also observed using Western blot. Results indicate that the ability to phosphorylate DivIVA returned with the complementation. These methods showed that afsK and sppA are necessary for the phosphorylation and dephosphorylation of DivIVA.

Observation of two ΔafsK strains gave quite diverging phenotypes. Upon closer investigation it was revealed that the mutants both had two different secondary deletions apart from afsK. Since these deletions could have an effect on the morphology a conclusion regarding the growth characteristics cannot be made. The ΔsppA strains did not have a very noticeable phenotypical effect either and more in-depth analysis is needed.

In summary, it is clear that afsK and sppA are needed for the phosphoregulation of DivIVA. However, this study cannot draw a reliable conclusion regarding the phenotype of the mutants. Future research on the phosphorylation sites and phosphoproteomics may aid in clarifying the role of AfsK activity.

Popular Abstract (Swedish)

Klibbiga grenar

Föreställ dig, en stilla promenad i lätt vårregn. Känn doften av fuktig jord. Jorddoften kommer från jordlevande bakterierna som kallas Streptomyceter. Då dessa bakterier utgör en av våra viktigaste källor till antibiotika är de särskilt intressanta att studera. Men hur växer de egentligen? I stället för att föröka sig via celldelning bildar dessa bakterier stora nätverk, likt rötter. Tillväxten av nya grenar styrs av ett protein kallat DivIVA som markerar var grenarna ska skjuta ut nya skott. Syftet med mitt arbete var att observera hur denna förgrening styrs i Streptomyces venezuelae.

I bakteriernas arvsmassa finns ärftlig information om bakteriens karaktärsdrag i form av DNA. En gen är små segment av DNA som bär informationen för tillverkningen av ett specifikt protein. Dessa proteiner påverkar bakteriens tillväxt och dess funktioner. I Streptomyceter har det upptäckts två proteiner som tros ha en betydelsefull roll för regleringen av nya grenars tillväxt. Dessa proteiner kallas AfsK och SppA. De reglerar proteinet DivIVA genom att sätta dit eller ta bort en fosfatgrupp. Denna process kallas fosforylering. Fosforyleringen av DivIVA tros ha betydelse för hur Streptomyceter växer genom förgrening.

För att titta närmare på detta har det skapats två mutanter av bakterien där generna som kodar för AfsK eller SppA har klippts bort. Dessa mutanter studerades mikroskopiskt samt med infärgningsmetoder, som visade ifall DivIVA fosforylerats, och jämfördes med den vilda omuterade bakterien. För att se ifall möjliga skillnader i dessa experiment återgick till den vilda bakteriens beteende komplementerades afsK-mutanterna med den förlorade afsK genen.

Förvånansvärt så upptäcktes det att de två afsK-mutanter som studerats inte hade samma utseende. En av dem hade grenar som klumpade ihop sig likt klibbig spagetti medan den andra mutantens grenar spred sig fritt utan kontakt (se bild). Analys av arvsmassan indikerade en sekundär mutation där flera gener hade klippts ut, vilket gav stor påverkan på den klumpbildande bakteriens utseende. Det fanns däremot resultat som tyder på att DivIVAs fosforyleringsreglering är beroende av AfsK och SppA.

Att utreda utseendet på mutanterna visade sig vara komplicerat, men trots det så kunde betydelsen av AfsK och SppA fastställas. I frånvaro av AfsK och SppA sker regleringen av DivIVA inte på samma sätt som hos den vilda S. venezuelae. Mutationerna verkade inte ge upphov till förändringar i utseendet, men ytterligare studier kommer behövas eftersom sekundära mutationer kan ha påverkat detta. Dessa fynd kan bidra till djupare förståelse om DivIVAs reglering samt identifiera ytterligare proteiner som potentiellt fosforyleras av AfsK.
Och allt detta händer under dina fötter under en promenad i vårregnet.

Masterexamensprojekt i Molekylärbiologi 45 hp 2026
Biologiska institutionen, Lunds universitet

Handledare: Klas Flärdh
Biologiska institutionen, Lunds universitet

• author: Moberg, Linnéa
• supervisor: Klas Flärdh
• organization: Degree Projects in Molecular Biology
• course: MOBN02 20252
• year: 2026
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Biology and Life Sciences
• language: English
• id: 9226044
• date added to LUP: 2026-05-08 13:40:14
• date last changed: 2026-05-08 13:40:14