Integrated Chromatographic Systems for On-Line Bioprocess Monitoring Based on Microdialysis or Tangential Flow Filtration

Abstract

Systems for on-line monitoring of bioprocesses were developed, consisting of a membrane-based sampling unit, a liquid chromatographic (LC) separation step, and a detector. Two sampling units, a tangential flow filtration (TFF) module and a microdialysis probe, were characterised and evaluated for use in different types of bioprocesses. When using the TFF module, an additional sample clean-up step based on solid phase extraction (SPE) was found to be mandatory to protect the chromatographic column. In contrast, the dialysate from the microdialysis probe was less complex and could be directly injected into the LC column, thus omitting the SPE step. Various modes of LC, especially ligand-exchange and anion-exchange chromatography, were utilised for separation of carbohydrates and alcohols in the bioprocess samples. These analytes were then detected by refractive index, electrochemically, or by in-house made enzyme-based amperometric biosensors. The enzymes used in the biosensors were specific for a group of compounds rather than one-substrate specific, and the sensors could therefore be used as selective LC detectors. Data acquisition and presentation of the signals from the detectors were made using chromatographic software. The parts were integrated into several different on-line systems that allowed the unattended monitoring of both substrates and products during fermentations. Three different bioprocesses were studied: the production of fuel ethanol from lignocellulosic materials (the main focus of this work), the enzymatic hydrolysis of biopolymers, and the production of inositol trisphosphate from phytic acid.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

För drygt tio år sedan startade ett forskningsprojekt mellan fyra avdelningar på Kemicentrum i Lund i syfte att ta fram en process för framställning av etanol ur snabbväxande energiskog. Etanol är ett miljövänligt alternativ till bensin som drivmedel för bilar och bussar, och redan idag körs ungefär 100 bussar i svenska städer på detta bränsle. Priset på drivmedelsetanolen är idag högre än bensinpriset, och för att kunna sänka priset måste framställningsprocessen göras mera effektiv. I denna avhandling har förutom denna ³etanolprocess² två andra processer har också studerats: tillverking av ett potentiellt läkemedel, och framställning av så kallade biopolymerer ur trä (Artikel VI). För enkelhetens skull redovisas bara den förstnämnda nedan.



Trä är i princip uppbyggt av cellulosa, hemicellulosa, och lignin. För att kunna jäsa sockret till etanol måste träet hydrolyseras i två steg för att frigöra de olika sockerarterna, först mekaniskt genom flisning, och sedan kemiskt eller med enzymer. Vid den efterföljande fermentationen omvandlar mikroorganismer sockerarterna till etanol, som sedan kan destilleras vidare till ca 95%, så kallad finsprit. För att etanolen skall bli så billig som möjligt, måste alla steg i processen vara så effektiva som möjligt. Detta kallas att optimera processen. Under själva fermentationen är det viktigt att kunna mäta vissa grundläggande parametrar, såsom pH och löst O2, och detta görs ofta genom att sänka ned elektroder i fermentorn. För att erhålla mer detaljerad information om förbrukningen av substraten och bildningen av intermediärer och produkter, är det vanligt att manuellt ta ut prover ur fermentorn och sedan i efterhand analysera dessa. Detta kräver dock en betydande arbetsinsats eftersom prover vanligen måste tas ofta och dessutom dygnet runt. Därför har det under de senaste 15 åren tagits fram mer eller mindre automatiska system för att ta prov från och analysera fermentationer. Dessa kallas på engelska för ³on-line monitoring systems², och denna avhandling beskriver utveckling av sådana system och dess ingående delar.



Ett on-line system består vanligen av tre till fyra delar: en provtagningsenhet , eventuell provupparbetning, ett separationssteg, och ett detektionssteg. Provtagningsenhetens funktion är att avskilja de små molekyler man är intresserad av från stora molekyler och fasta partiklar samt att transportera de förstnämnda från fermentorn till analyssystemet. Avskiljningen görs ofta genom att med hjälp av ett membran antingen dialysera eller filtrera lösningen i fermentorn. I Artikel I undersöktes och karakteriserades en extern filtreringsenhet, och den användes i Artikel IV som provtagningsenhet i ett automatiskt on-line system. Denna enhet var emellertid behäftad med en rad nackdelar, bl a var filtratet inte tillräckligt rent för att kunna analyseras direkt, så ett extra uppreningssteg var nödvändigt. Vi valde därför att i fortsättningen arbeta med mikrodialys, en teknik från början utvecklad för medicinska ändamål, men som visade sig fungera utmärkt för provtagning i en fermentor (Artikel II). Den lösning som erhölls från mikrodialysproben var så ren att den direkt kunde analyseras, och uppreningssteget var inte längre nödvändigt. Denna mikrodialysprob har sedan använts i olika on-line system (Artikel V och VI) och även studerats i mera detalj beträffande olika membrans inverkan på dialysresultatet (Artikel III).



För att kunna mäta halt och förekomst av flera ämnen samtidigt har genomgående en teknik som kallas vätskekromatografi använts. I en kolonn som man pumpar en vätska genom kan man separera en blandning av komponenter, så att mängden av varje ämne kan registreras separat. Registreringen sker med olika typer detektorer, som mäter t ex ämnets brytningsindex eller absorbans av ljus vid olika våglängder. I Artikel VII jämfördes två vätskekromatografiska system utrustade med olika detektorer. Beroende på att detektorerna fungerar på olika sätt, erhölls skillnader i analysresultatet för samma prov. Detta är ett problem vid jämförelser t. ex. mellan analyslaboratorier. En annan typ av detektor är biosensorn, som har använts i flera artiklar (IV, V, och VIII). Den består bl a av enzymer som har en ³inbyggd² biologisk förmåga att kunna känna igen enbart vissa ämnen i närvaron av tusentals andra. Denna förmåga kallas selektivitet. Genom att koppla igenkänningsmekanismen så att den för oss ger en användbar signal, kan biosensorn användas för att selektivt bara mäta vissa ämnen. Eftersom de prover som analyserats från jäsningen just har innehållit många andra ämnen förutom de intressanta, har biosensorn visat sig kunna ge en säkrare bestämmning än om vissa andra detektorer använts istället. Slutligen har dessa delar som studerats och optimerats fogats samman till flera olika datorstyrda on-line analyssystem. Dessa har sedan använts för att studera både utgångsmaterialen och produkter i de tre processer som nämndes i början, och jäsningar som varat i flera dygn har kunnat följas med mycket liten manuell insats.

• author: Buttler, Torbjörn
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Dr Lunte, Craig E., Department of Chemistry and Center for Bioanalytical Research, University of Kansas, USA
• publishing date: 1996
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Analytical Chemistry
• keywords: Analytisk kemi, Analytical chemistry, monitoring, microdialysis, liquid chromatography, filtration, ethanol, bioprocess, carbohydrates, biosensor detection
• pages: 72 pages
• defense location: Lecture hall C, Chemical Center, Lund
• defense date: 1996-03-29 10:30:00
• external identifiers: other:ISRN: LUNKDL/(NDKAK-1034) 1-172 (1996)
• language: English
• LU publication?: no
• additional info: The information about affiliations in this record was updated in December 2015. The record was previously connected to the following departments: Analytical Chemistry (S/LTH) (011001004)
• id: 13903655-0322-4fcd-a66f-3a12acad7132 (old id 28302)
• date added to LUP: 2016-04-04 10:43:29
• date last changed: 2018-11-21 21:00:25