Calcium channel activity and force regulation in smooth muscle: Effects of polyamines and growth stimulation.

Abstract

The initial signal for contraction in smooth muscle is an increase in [Ca2+]i. Ca2+ ions can either enter the cytosol from the extracellular medium or be released from intracellular stores. Voltage-operated Ca2+ channels (VOC) play a dominant role in the activation of smooth muscle contraction. This thesis describes two novel regulatory mechanisms of the dihydropyridine (DHP)-sensitive VOC in smooth muscle. One of them involves the polyamines spermine (SP) and spermidine (SPD), and the other, a Ca2+-dependent modulation brought about by growth stimulation with foetal calf serum (FCS). The polyamines SP and SPD, ubiquitous polycations associated with cell growth and differentiation, inhibited electrical membrane activity and contraction in intestinal and vascular smooth muscle. We showed in guinea-pig ileum that this was due to inhibition of current through L-type Ca2+ channels. SP and SPD also increased Ca2+ sensitivity of the contractile system. Culture with the adenosylmethionine decarboxylase antagonist CGP 48664 reduces SP and SPD contents by more than 50 % and causes enhanced Ca2+ channel activity. This is consistent with increased spontaneous activity observed after culture with CGP 48664. Culture of intestinal smooth muscle with FCS reduced sensitivity of force to extracellular Ca2+ by a functional decrease in Ca2+ channel density. Downregulation of inward current was mediated by an increased [Ca2+]i, since it was reversed by the Ca2+ channel blocker verapamil and mimicked by the Ca2+ ionophore ionomycin. We conclude that the increased [Ca2+]i brought about by culture with FCS gives rise to a persistent and trophic modulation of L-type Ca2+ channel, in contrast to the direct modulation exerted by altered endogenous polyamines.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Kroppens rörelser åstadkommes genom sammandragning av muskelvävnad som kan vara av två slag, glatt eller tvärstrimmig. Den senare sorten kan indelas i skelett och hjärtmuskulatur, vilka har mycket olika egenskaper trots den gemensamma benämningen. Muskelvävnaden är uppbyggd av långsträckta, spolformade celler som innehåller tunna och tjocka kontraktila filament, bestående av proteinerna aktin respektive myosin. Namnet glatt ("smooth") härrör från muskulaturens släta utseende i ljusmikroskop, i motsats till tvärstrimmig som visar omväxlande mörka och ljusa partier som beror på regelbundet arrangemang av de kontraktila filamenten. Den glatta muskulaturen uppträder i regel som mer eller mindre tydligt utbildade skikt i väggarna av blod- och lymfkärlen, mag-tarmkanalen, luftvägarna m. fl. inre organ. Även hårsäckarna innehåller glatt muskulatur. Till skillnad från skelettmuskulatur står glatt muskulatur ej direkt under viljans inflytande.



Olika signaler förmedlade via nerver, hormoner eller mekanisk uttänjning kan, genom att öka koncentrationen av kalciumjoner inne i cellen, ge upphov till förkortning och kraftutveckling. När kalcium då stiger, antingen genom inflöde via kanaler i cellmembranet eller genom frisättning från intracellulära förråd (sarkoplasmatiskt retikel, SR), binder det till proteinet calmodulin och tillsammans aktiverar de ett enzym (myosin light chain kinase, MLCK) som genom fosforylering aktiverar de tjocka filamenten. Det aktiva myosinet kan sedan interagera med aktinet, och under förutsättning att kemisk energi finns tillgängligt, uppstår dragkraft. Följaktligen kan kraftutvecklingen regleras i glatt muskulatur genom att kalciumkoncentrationen i cellen och/eller "känsligheten" för kalcium hos det kontraktila systemet påverkas.



Denna avhandling behandlar elektrofysiologiska effekter av polyaminerna spermin (SP), spermidin (SPD) och putrescin (PUT) samt av tillväxtstimulering med fetalt kalvserum (FCS) på glatt muskulatur. Effekterna på kalciumkanaler studeras med hjälp av patch-clamptekniken, som först användes av Neher och Sakmann (1976) för att upplösa strömmar genom enskilda kanaler i skelettmuskelmembran. Metoden de använde ledde till ett antal olika varianter som är baserade på samma princip: att elektriskt isolera en bit ("patch") av membran från den omgivande lösningen och sedan registrera ström som flyter genom patchen. Detta möjliggörs med hjälp av en polerad glaspipett, som är fylld med en lämplig elektrolytlösning. Pipettspetsen närmas till cellytan och genom en lätt sugning fås den att täta ("seal") mot denna. Avståndet mellan glaset och membranet är mindre än 1 nm och den elektriska resistansen över förbindelsen större än 10 gigaohm. En hög seal resistans minskar brusnivån och tillåter registrering av strömmar i storleksordning av pA. I avhandlingsarbetet registrerades kalciumströmmar på isolerade glatta muskelceller som kan ha 5-20 mm i diameter och flera hundra mm i längd.



Polyaminer är normalt förekommande positivt laddade molekyler som finns i alla levande celler och vars koncentration stiger i snabbt tillväxande vävnad. Det har dessutom visats att man kan hämma celltillväxt genom att farmakologiskt angripa polyaminsyntesen. I det första arbetet visar vi att SP och SPD, men inte PUT hämmar kalciuminflöde genom s.k. "L-typ" kalciumkanaler i tunntarmsmuskulatur (ileum) från marsvin, vilket förklarar varför SP och SPD hämmar glatta muskelcellers spontana elektriska och mekaniska aktivitet. Effekten uppnås både vid extracellulär och intracellulär applikation av polyaminer. I det andra delarbetet studeras effekter av polyaminer på portaven från råtta och påvisas att SP och SPD hämmar spontan elektrisk aktivitet i kärlpreparat. Dessutom visas att höjning av den intracellulära polyaminkoncentrationen ökar känsligheten för kalcium hos det kontraktila maskineriet. I det tredje delarbetet manipuleras polyaminkoncentration i ileum genom hämning av cellernas egen produktion och på det sättet undersöks polyaminernas betydelse för kalciumkänsligheten och membranegenskaper. Hämning av polyaminsyntesen reducerade innehållet av SP och SPD till mer än hälften, och detta medförde en ökning i aktivitet hos kalciumkanalen. Fyndet överensstämmer med tidigare resultat från vårt laboratorium, då efter samma behandling, ökad spontan aktivitet och känslighet för kalcium iakttogs. Polyaminerna verkar ha djupgående effekter på reglering av den glatta muskulaturens funktion, samtidigt som de tydligen deltar i cellens tillväxtkontroll.



I det fjärde delarbetet utreder vi lång tidseffekterna av vävnadsodling i närvaro av tillväxtstimulerare (FCS). Efter fem dagars odling av ileum preparat fann vi att närvaro av FCS minskade kraften. Denna effekt visades bero på minskat antal kalciumkanaler i cellmembranet. Nedregleringen av kalciumkanaler kunde förhindras genom tillsats av en kalciumkanal blockare (verapamil) under odling med FCS. Dessutom kunde effekten framkallas utan FCS genom odling i närvaro av ett ämne (ionomycin) som ökade permeabiliteten för kalcium i cellmembranet. Detta resultat samt det faktum att serum vid akut applikation vanligtvis ger upphov till ökning av intracellulär kalcium tyder på att det är kalciumnivåerna inne i cellen som på lång sikt modulerar uttrycket av fungerande kalciumkanaler.

• author: Gomez, Maria
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Prof Gurney, Alison M., Dept. of Physiology and Pharmacology, University of Strathclyde, Royal College, Glasgow.
• organization: Cardiovascular Research - Immunity and Atherosclerosis (research group)
• publishing date: 1998
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Cardiac and Cardiovascular Systems
• keywords: verapamil, tissue culture, portal vein, patch-clamp, calcium, spermidine, spermine, polyamines, excitation-contraction, smooth muscle, calcium channel, ionomycin., Physiology, Fysiologi
• pages: 110 pages
• defense location: Segerfalksalen, Wallenberg Neuroscience Center, Sölvegatan 17, Lund
• defense date: 1998-10-02 10:15:00
• external identifiers: other:ISRN: LUMED/MEFN--18--SE
• ISBN: 91-628-3076-7
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 7f16a36e-d879-4563-b5a5-b480d582ef59 (old id 38858)
• date added to LUP: 2016-04-04 12:19:14
• date last changed: 2018-11-21 21:10:16