Molecular studies of pancreatic cancer: Characterization of the transforming growth factor beta signaling pathway

Abstract

In the present thesis, genetic abnormalities in pancreatic cancer were studied, with special emphasis on alterations of components involved in the transforming growth factor beta (TGFB) signaling pathway. In the first study, fluorescence in situ hybridization and cytogenetic analyses revealed aberrations of chromosome 18 in all 13 pancreatic carcinoma cell lines studied, in particular frequent breaks close to the centromere of chromosome arm 18q. The results suggested the presence of at least one tumor suppressor gene (TSG) at 18q, one candidate being SMAD4, which is a key component of the TGFB signaling pathway. The second study was initiated to investigate the role of five SMAD genes involved in TGFB signaling, i.e., the potential TSGs SMAD2 (18q), SMAD3 (15q), and SMAD4 (18q), as well as the putative oncogenes SMAD6 (15q) and SMAD7 (18q). Loss of heterozygosity and mutation analyses revealed frequent loss of 18q material and SMAD4 inactivations in 5 of 12 cases, whereas no mutations of SMAD2, SMAD3, SMAD6, or SMAD7 were detected. In the third study, the TGFB receptors were investigated. No mutations of TGFBR2 or ALK5 (TGFBR1) were found, expression of TGFBR2 and TGFB3 was maintained or increased, whereas ALK5 was downregulated. The response to TGFB was analyzed in 12 pancreatic carcinoma cell lines, half of which responded by an increase in proliferation. In the fourth study, filter-based microarrays were used to study TGFB induced gene expression alterations. The results demonstrated that pancreatic cancer cell lines with SMAD4 mutations still respond to TGFB treatment. In addition, a gradual inverse gene expression pattern as compared to TGFB sensitive control cells was observed in the pancreatic carcinoma cell lines that correlated with reduced sensitivity to TGFB growth inhibition. In the fifth study, polymerase chain reaction (PCR) protocols for gene expression and gene copy analyses were developed. In summary, the results of the present thesis suggest that partial inactivation of the TGFB signaling pathway, e.g., SMAD4 inactivation and downregulated ALK5 expression, in conjunction with other genetic alterations gradually alter the ability of pancreatic tumor cells to be growth inhibited by TGFB. The most important finding was the detected ability of half of the investigated cell lines to be growth stimulated by TGFB, thus providing a basis for future investigations of the biphasic effects of TGFB observed during the progression of many different tumor types.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Pankreascancer (cancer i bukspottkörteln) drabbar ungefär 900 personer om året i Sverige. Tumörformen har tidigare varit vanligare hos män men är numera lika vanlig hos män och kvinnor. Pankreascancer är ovanligt före 40 års ålder, men ökar stadigt med åldern och ungefär 80% av dem som drabbas är över 60 år gamla. Pankreascancer är en aggressiv tumörform och på grund av otydliga symptom upptäcks tumörerna ofta inte förrän de redan har spridit sig i kroppen. Tumörcellerna är relativt okänsliga för kemoterapi och strålningsbehandling. Behandlingen är därför svår och prognosen för patienterna mycket dålig. Idag är det inte möjligt att bota denna tumörform om cancercellerna har spridit sig utanför bukspottkörteln. I de flesta fall inriktas därför behandlingen på att minska symptom snarare än på att bota sjukdomen. En ökad kunskap om de genetiska förändringar som orsakar sjukdomen kan förhoppningsvis leda till nya behandlingsmetoder och bättre möjligheter att upptäcka tumörerna på ett tidigt stadium. Vår arvsmassa, DNA, finns i cellens kärna och är lagrade i 23 par kromosomer. Ena parten i dessa par har vi ärvt från vår far och den andra parten från vår mor. Varje kromosom har två armar − en kort (p-armen) och en lång (q-armen) − och innehåller tusentals olika arvsanlag (gener). Kromosomerna kan färgas med olika färgämnen så att det går att urskilja ett unikt bandningsmönster på varje kromosom, vilket möjliggör identifieringen av olika kromosomer. Cancer orsakas av genetiska förändringar i enskilda celler, vilket leder till att dessa celler delar sig okontrollerat. Dessa genetiska förändringar kan t.ex. bestå av att gener som normalt hämmar celldelning är förlorade (tumörsuppressorgener) eller att gener som befrämjar celldelning är överaktiva (onkogener). Vår kropp innehåller ett mycket stort antal celler och för att den skall fungera normalt krävs att inga celler tillväxer på andras bekostnad. Celler som har omvandlats till tumörceller känner inte längre av några begränsningar utan växer ohämmat och kan förstöra vävnaderna omkring sig. Normala celler påverkas av sin omgivning och slutar växa och dela sig om de får signaler utifrån att göra detta. Ett viktigt sätt för kroppen att upprätthålla balansen mellan olika celler och vävnader är att cellerna kommunicerar med varandra genom att utsöndra proteiner som reglerar varandras tillväxt och delning (tillväxtfaktorer). En sådan tillväxtfaktor är TGFB, som normalt minskar tillväxten av de celler som utgör ytskiktet (epitelceller) i de gångar i bukspottkörteln som exporterar matsmältningsenzymer till tunntarmen. Det är förändringar i dessa ytceller som kan leda till pankreascancer. Syftet med mitt doktorandarbete var att identifiera genetiska förändringar i pankreastumörer. Ett huvudmål var att öka förståelsen för hur cancercellerna undgår den tillväxthämmande effekt som normalt utövas av signalproteinet TGFB. TGFB signalerar genom att binda till receptorer (mottagarproteiner på cellytan). Dessa receptorer vidareförmedlar signalen genom att aktivera proteiner inne i cellen (SMAD-proteiner) som i sin tur vandrar in i cellkärnan och påverkar uttrycket av ett flertal gener, dvs hur många gånger dessa gener läses av för att översättas till proteiner. Förluster av den långa armen på kromosom 18 (18q) är vanligt förekommande i pankreastumörer. Denna kromosomarm innehåller en gen, SMAD4, som kodar för ett protein involverat i TGFBs signalering från cellytan till cellkärnan. SMAD4 har tidigare visats vara förändrad (muterad) eller förlorad i pankreastumörer. Vi ville veta i detalj hur kromosom 18 ser ut i pankreastumörer och därför undersökte vi denna kromosom med hjälp av en metod som kallas FISH (fluorescence in situ hybridisering). Från denna undersökning kunde vi se att nästan samtliga undersökta tumörer hade brottspunkter i kromosombanden 18q11-12. SMAD4 är belägen längre ner (18q21) och det är möjligt att det finns ytterligare tumörsuppressorgener längre upp på kromosomarm 18q eftersom brottspunkterna är belägna så pass högt upp som 18q11-12 (artikel I). Vi undersökte uttrycket av de fem SMAD-gener som är inblandade i överföringen av TGFB signalen från cellytan till cellkärnan och genomförde även en mutationsanalys av dessa gener. Vi kom fram till att SMAD4 var muterad i knappt hälften (42%) av tumörerna. Resultaten visade att mutationer av SMAD4 troligen är av central betydelse för uppkomsten av pankreascancer. Dessa mutationer verkar dessutom vara utmärkande för pankreascancer eftersom de är mycket ovanliga i andra typer av tumörer (artikel II). Vi frågade oss om det är möjligt att de tumörer som inte har SMAD4-mutationer har genetiska förändringar på andra ställen i TGFBs signalkedja, vilket gör dem okänsliga för TGFB-medierad tillväxthämning. Därför studerade vi uttrycket av de tre gener som kodar för de receptorer som TGFB binder till. Vi utförde även en mutationsanalys av dessa gener. Vi hittade inga mutationer, men uttrycket av en av receptorerna (ALK5) var kraftigt minskad. För att se om pankreastumörerna stimuleras eller undertrycks av TGFB odlade vi tumörceller och tillsatte TGFB i olika koncentrationer. Det visade sig att alla utom en av tumörerna var resistenta mot TGFB-medierad tillväxthämning och att hälften av de studerade tumörerna stimulerades till att växa av TGFB, tvärtemot den normala reaktionen (artikel III). För att studera vilka gener som aktiveras eller nedregleras av TGFB i pankreastumörer utnyttjade vi så kallad array teknik (artikel IV). Med hjälp av denna teknik kan man studera uttrycket av ett mycket stort antal gener samtidigt och på så sätt få en global bild av vad som händer i cellen under olika förhållanden. Resultaten i artikel IV visade att trots att SMAD4 var muterad så kunde tydliga reaktioner observeras efter TGFB behandling. Vi kunde också se ett motsatsförhållande mellan rektionen på TGFB i normala kontrollceller (HaCaT-celler) och i celler från två pankreastumörer. I artikel V har vi sammanställt våra erfarenheter av uttrycksanalyser av gener med hjälp av metoden polymerase chain reaction (PCR). I artikel V beskriver vi även en ny metod för att bestämma kopieantalet av olika gener i DNA med hjälp av PCR och en internstandard L1Hs. Sammanfattningsvis visar avhandlingen att förluster av delar av kromosomarm 18q är ett viktigt steg under uppkomsten av pankreascancer. Studierna av TGFBs signalkedja identifierade en hög frekvens av SMAD4 mutationer och nedreglering av ALK5 expression medan andra delar av signalkedjan föreföll relativt oförändrad i de undersökta pankreastumörerna. Flera pankreastumörer var inte endast resistenta mot TGFB medierad tillväxthämning utan uppvisade även en ökad tillväxt när de behandlades med TGFB, tvärtemot den normala reaktionen.

• author: Jonson, Tord
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Dr Gress, Thomas, Ulm, Germany
• organization: Division of Clinical Genetics
• publishing date: 2001
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Medical Genetics
• keywords: SMAD4, PCR, FISH, cytogenetics, chromosome, pancreatic cancer, TGFB signaling, cytogenetik, Genetik, Genetics
• pages: 130 pages
• defense location: Central hospital building in Lund, lecture room F1
• defense date: 2001-11-29 10:00:00
• ISBN: 91-628-4986-7
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 3babe179-0cb1-40cc-a182-7dd0d0f566aa (old id 42050)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:30:29
• date last changed: 2018-11-21 21:05:18