Immunohistochemical study of rats receiving peripheral immunization with IFNg transfected glioma cells

Abstract

Malignant glioma is, with rare exceptions in younger adults, an uncurable brain tumor, as very few survive more than 1-2 years after diagnosis. Despite advances in recent years, current treatments such as surgery, radiotherapy and chemotherapy only prolongs the life of the patients. Because of the poor prognosis, several additional therapies have been investigated and are under development, such as different immunotherapeutic strategies. Experimental models have shown that by enhanced antigen presentation, support of various immune functions with the addition of, for example, cytokines as well as inhibition of immunosuppressive factors, it is possible to reject growing tumors in the brain. The aim of this thesis was to study the immune response in rats receiving therapeutic immunization with glioma cells genetically engineered to express IFNg. IFNg is a multifunctional cytokine that has been shown to affect different immune functions such as the stimulation of phagocytosis and antigen presentation, as well as trafficking of leukocytes and induction of Th1 immune responses. More specifically, in study I we refined an immunohistochemical method and a computerized image analysis method to systematically evaluate variations in leukocyte infiltration between different immunotherapies. These methods were used in study II-IV. In study II, we investigated the kinetics as well as the amount of different leukocyte subtypes that infiltrated brain tumors of rats receiving immunization with IFNg transfected glioma cells. In studies III and IV, we characterized the local immune response in rats receiving immunotherapy with IFNg. Taken together, the data presented in this thesis show that IFNg induced an increased infiltration of TCR+ cells, CD8+ cells and NK-cells in brain tumors of rats receiving immunotherapy, as compared to control animals. IFNg induced a specific infiltration of TCR+ cells, CD8+ cells and NK-cells at the immunization site. Tumor cells were engulfed by mononuclear phagocytes and were transported to draining lymph nodes. We believe that these specific mechanisms are responsible for the therapeutic effects seen in animals immunized with IFNg transfected glioma cells.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Vi har studerat hur man kan använda immunsystemet för att behandla råttor med hjärntumör (maligna gliom). Eftersom råttor väldigt sällan utvecklar hjärntumörer, så måste vi injicera tumörceller i hjärnan själva. Om djuren inte får någon behandling dör de vanligen inom ca. 24 dagar. Får de däremot en injektion i buken eller under huden på benet med genmanipulerade tumörceller, så överlever upp till 70% av råttorna. Tumörcellerna har manipulerats så att de producerar ett protein som de normalt inte uttrycker, nämligen interferon gamma (IFNg).



När de IFNg-producerande tumörcellerna sprutas in i råttan kommer de i kontakt med specialiserade celler som äter upp tumörcellerna och presenterar bitar (antigen) av dessa på sin egen yta. Dessa presentationsceller (antigen presenterande celler – APC) ger sig iväg till lymfoida organ, som lymfkörteln, för att presentera tumörcellerna, eller delar av dem, för andra specialiserade celler, T-cellerna. Man tror att APC visar upp tumörcellerna för olika typer av T-celler, T-hjälpar (Th) celler och cytotoxiska T-celler (CTL). Th-celler samt även APC aktiverar i sin tur CTL. CTL lämnar sedan lymfkörteln för att via blodet bege sig till det ställe där samma sorts antigen som de blivit aktiverade emot finns. I vårt fall beger de sig till tumören uppe i hjärnan, samt även till injiceringsstället. Där kan de via sina ytstrukturer binda in till andra ytstrukturer på tumörcellerna och utsöndra cytotoxiska substanser som bidrar till att tumörcellerna dör. Man tror även att det finns andra immunceller som hjälper till med att döda tumörceller, t.ex. NK-celler, makrofager, dendritiska celler och granulocyter. På vilket sätt de dödar tumörceller är inte klarlagt, men det har visat sig att även de kan producera cytotoxiska substanser. Tumörcellerna i sin tur har utvecklat olika försvarsmekanismer för att undvika att bli dödade av immunsystemets celler. Exempel på sådana försvarsmekanismer är t.ex. produktion av olika substanser som hämmar immuncellernas tillväxt eller hämmat uttryck av de ytstrukturer som CTL binder till.



Man tror att det bara är i de lymfoida organen som immunceller kan aktiveras på ett effektivt sätt. Eftersom hjärntumörer vanligen inte sprider sig utanför hjärnan, och eftersom det inte finns några lymfoida organ i hjärnan, så måste immunförsvarscellerna och tumörcellerna interagera med varandra utanför hjärnan för att ett effektivt immunsvar ska initieras. Därför sprutar vi in IFNg-producerande tumörceller i buken eller under huden. IFNg tillhör en grupp av proteiner som kallas cytokiner. IFNg påverkar bl.a. presentationen av tumörceller för T-cellerna, stimulerar tillväxt av T-celler och inducerar produktion av cytotoxiska substanser. Vi tror att IFNg hjälper till med att aktivera immunförsvarets celler på ett fördelaktigt sätt, så att tumören i slutändan avstöts trots att tumören utsöndrar immunhämmande ämnen.



Vi vill förstå varför injektioner med IFNg-producerande tumörceller kan bota ett visst antal av de råttor som har hjärntumör. Den här avhandlingen handlar om vilka immunceller som först tar kontakt med de genmanipulerade tumörcellerna vid injiceringsstället och vad de producerar. Vi tittar också på vilka immunceller som tar sig till hjärntumören och vad de i sin tur producerar. Vi beskriver även en metod som vi använt för att på ett snabbt och reproducerbart sätt kunna visualisera vad som sker vid injiceringsstället och i hjärntumören.



I Arbete I beskriver vi en standardisering av de metoder; immunhistokemi, fotografering av snitt och datoriserad bildanalys, som ligger till grund för arbete II, III och IV. I det här arbetet har metoderna använts för att detektera skillnader i de antal/mängd celler som infiltrerar hjärntumörer hos råttor som fått immunterapi jämfört med hjärntumörer hos kontrollbehandlade råttor. För att kunna analysera ett stort material och för att kunna jämföra olika grupper med varandra på ett snabbt och reproducerbart sätt, är det viktigt att arbeta med standardiserade metoder. Vi valde att automatisera tillsättandet av reagenser till vävnadssnitten för att standardisera den immunhistokemiska proceduren. Vid fotografering av vävnadssnitten använde vi oss av ett mikroskopobjektiv med låg förstoring samt en kamera med mycket hög upplösning. Den höga bildkvalitén är en förutsättning för den datoriserade bildanalysen. Syftet med detta var att få en enda bild av vävnadssnittet som täcker hela tumörområdet, men som har tillräckligt hög upplösning för att varje cell ska framträda tydligt. Vi tog dessutom flera bilder i högre förstoring motsvarande samma tumöryta, och lade ihop till en bild, men det är en mer tidskrävande procedur. Med hjälp av det datoriserade bildanalysprogrammet kunde vi beräkna hur stor yta de färgade cellerna täckte jämfört med den totala tumörytan. Data kan sedan presenteras i grafer, vilket gör resultatet mer överskådligt och lättare att jämföra.



I Arbete II använde vi oss av metoderna som beskrivits i Arbete I för att studera vilka celler och mängden av dessa celler som infiltrerar hjärntumörer hos råttor som fått injektioner/blivit immuniserade med IFNg-producerande tumörceller jämfört med olika kontrollgrupper. Genom att studera tumörer som tagits ur djuren vid olika tidpunkter kunde vi också få en uppfattning om när olika typer av celler infiltrerar. Inflödet av olika immunceller till tumören tror man beror på hur blodkärlen ser ut, därför studerade vi även mängden kärl och hur stora de var i tumörer som plockats ut vid olika tidpunkter. Vi visar att det börjar bildas synliga kärl 7 dagar efter det att tumören bildats, och att de växer både i antal och storlek fram tills dess att djuren avlivas dag 24. Granulocyter är den celltyp som infiltrerar först i tumören, redan 3 dagar efter det att tumörceller sprutats in. Efter 10 dagar börjar T-celler att infiltrera, tätt följda av vävnads specifika makrofager. Vi visar också att det är ett större inflöde av T-celler och NK-celler i tumörer hos de djur som fått en injektion med IFNg-producerande tumörceller.



I Arbete III använde vi oss av de metoder som beskrivits i Arbete I för att kunna detektera produktionen av ett protein, inducerbart kväveoxidsyntetas (iNOS), vid injektionsstället, i dränerande lymfkörtlar och i mjälte hos djur som fått IFNg-producerande tumörceller, jämfört med kontroll grupper. Olika tidpunkter efter injiceringen studerades. För att kunna studera detta immunhistokemiskt, injicerades tumörcellerna inuti huden på djur utan hjärntumör. På så sätt är det mycket enklare att isolera injektionsstället än om cellerna sprutades i buken. Immunfluorescens användes för att ta reda på vilka celler som producerade iNOS. Vi undersökte också om vi kunde detektera samma protein i hjärntumörer hos djur som fått IFNg-producerande tumörceller injicerade i buken. iNOS är ett enzym som hjälper till med bildandet av den cytotoxiska substansen kväveoxid (NO). Man tror att produktion av NO kan påverka tumörers tillväxt, hämma immunsvaret mot tumörer men även fungera som en cytotoxisk substans som hjälper till med att döda tumörceller. Det har visat sig att IFNg påverkar bildandet av iNOS. I det här arbetet visar vi att det finns mer iNOS i injektionsstället och i hjärntumörer hos de råttor som fått IFNg-producerande tumörceller vid alla tidpunkter som undersöktes jämfört med kontrollråttor. Vi kunde inte hitta iNOS, varken i dränerande lymfkörtlar eller mjälte hos någon av de undersökta grupperna. Vi visar också att det är ett förstadium till de antigenpresenterande cellerna, mononukleära fagocyter, som producerar iNOS, både i huden och i tumören.



I Arbete IV fortsatte vi att studera den immunologiska reaktionen vid injektionsstället hos de djur som blivit immuniserade med IFNg producerande tumörceller jämfört med kontroll djur. Transport av tumörcellsbitar till lymfkörtlarna undersöktes också efter tillsats av IFNg producerande tumörceller blandade med olika koncentrationer av rekombinant IFNg. Vi färgade tumörcellerna gröna med en fluorescerande färg innan de injicerades för att kunna studera vilka celler som fungerar som APC, samt hur mycket av tumörcellsmaterialet som transporteras till de dränerande lymfkörtlarna. Vi använde oss av immunfluorescens för att karakterisera de antigenpresenterande cellerna ytterligare. Samma metod som beskrivits i Arbete I användes för att studera vilka celler och mängden av dessa celler som infiltrerar injektionsstället. Vi visar att vi har ett större inflöde av T-celler, NK-celler och celler som uttrycker CD8 i injiceringsstället hos de djur som fått IFNg-producerande tumörceller. Vi visar också att tumörceller omges av APC redan 1 dag efter injicering. De mononukleära fagocyterna äter upp tumörcellerna och bitar av tumörceller hittades inuti dessa 3 dagar efter injicering, både i huden och i de dränerande lymfkörtlarna. Det var ingen skillnad mellan de undersökta grupperna. Karakterisering av de mononukleära fagocyterna visade att några av de celler som innehöll tumörcellsbitar uttryckte ett visst protein, CD8, på sin yta. CD8 är ett protein som företrädelsevis uttrycks av cytotoxiska T-celler. Det visade sig också att IFNg ökar transporten av tumörcellsmaterial till de dränerande lymfkörtlarna.



Sammanfattning: Det finns många olika former av cancer och ännu fler är de metoder som utvecklats för att försöka bota cancer. Det har länge varit känt att det är möjligt för immunceller att känna igen och döda tumör celler. Däremot är det väldigt svårt att förmå immunsystemet att avstöta stora, växande tumörer. Inom forskningen använder man sig av olika djurförsöksmodeller i syfte att lära känna hur immunsystemet och tumören interagerar med varandra, så att man i framtiden kan förstå tillräckligt mycket för att applicera behandlingen på människa.



Vi har tidigare visat att immunterapi med IFNg kan leda till avstötning av hjärntumörer hos råtta. I den här avhandlingen ville vi studera på vilket sätt IFNg påverkar immunsystemet. Vi tror att IFNg bidrar till en effektivare presentation av tumörcellsmaterial vid injiceringsstället samt en effektivare transport till dränerande lymfkörtlar. Detta skapar förbättrade förutsättningar för en ökad aktivering av de immunceller som till slut hjälper till med att avstöta hjärntumören. Dessa resultat hoppas vi kunna använda för att vidareutveckla den IFNg-baserade immunterapi som nyligen initierats på människa.

• author: Darabi, Anna
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Docent Spetz, Anna-Lena, KI, Sweden
• organization: Neurosurgery
• publishing date: 2003
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Genetics
• keywords: Immunology, serology, transplantation, Immunologi, serologi, immunohistochemistry, IFNg, therapeutic immunization, malignant glioma, rat
• pages: 135 pages
• defense location: Sölvegatan 29, Lund
• defense date: 2003-02-07 10:15:00
• ISBN: 91-628-5522-0
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Article: Anna C Johansson, Edward Visse, Bengt Widegren, Hans-Olov Sjögren and Peter Siesjö. Computerized image analysis as a tool to quantitatively measure infiltrating leukocytes, A comparison with high- and low magnification images. Journal of Histochemistry and Cytochemistry (2001) 49:9 1073-1079. Article: Edward Visse, Anna C Johansson, Bengt Widegren, Hans-Olov Sjögren and Peter Siesjö. Immunohistochemical analysis of glioma infiltrating leucocytes after peripheral therapeutic immunization with IFNg transfected glioma cells. Cancer Immunology Immunotherapy (2000) 49:3 142-151. Article: Anna C Johansson, Pontus Hegardt, Shorena Janelidze, Edward Visse, Bengt Widegren and Peter Siesjö. Distinct expression of iNOS at the immunization site and intratumorally after therapeutic immunization with IFNg secreting rat glioma cells. Journal of Neuroimmunology (2002) 123 135-143. Article: Anna Darabi, Shorena Janelidze, Maria Larsson, Edward Visse, Bengt Widegren and Peter Siesjö. Increased infiltration of leukocytes at the immunization site and increased transportation of tumor cell debris to lymph nodes in rats receiving intra-dermal immunization with IFNg-transfected glioma cells. Manuscript. The information about affiliations in this record was updated in December 2015. The record was previously connected to the following departments: Genetics (Closed 2011) (011005100), Neurosurgery (013026000)
• id: 81cb3b58-58a4-4c7a-baba-4a23e056bd20 (old id 465404)
• date added to LUP: 2016-04-04 10:52:10
• date last changed: 2018-11-21 21:01:16