On the antiporter-like subunits of respiratory chain Complex I - implications for the evolution and coupling mechanism of the NADH:quinone oxidoreductase enzyme complex

Abstract

Complex I or NADH:quinone oxidoreductase is the largest enzyme complex, but the least understood energy coupling site in the respiratory chain of mitochondria and bacteria. No high-resolution structural information exists for this enzyme and the molecular mechanism that couples electron transfer and proton pumping is not understood. In mammals, about 50% of the mitochondrial DNA is encoding protein subunits of Complex I, and thus there is a strong correlation between defect Complex I and various degenerative diseases. Learning more about Complex I is thus important both for basic science and for medicine.



Complex I contains three large membrane-spanning subunits, NuoL, NuoM and NuoN, that are homologous to one particular class of Na+/H+ antiporters and therefore are likely to harbor important components of the proton translocation machinery. MrpA and MrpD belong to this class of Na+/H+ antiporters and are found in a gene cluster containing seven genes, mrpA-G. In this work the transmembrane topology of the antiporter-like subunits was determined and their phylogenetic relationship investigated. In the analysis MrpA and MrpD formed distinct branches where NuoL grouped with MrpA and NuoM/N with MrpD. The result suggest that there are functional differences between the MrpA/NuoL and MrpD/NuoM proteins. The remaining proteins encoded by the mrp gene cluster were analyzed by PSI-BLAST, a bioinformatical search tool that more efficiently detect distant homologies. MrpC was found to be a NuoK homologue, and thus we conclude that NuoK, NuoL and NuoM where recruited together to Complex I, from the antiporter module MrpC, MrpA and MrpD. A functional difference between MrpA and MrpD was confirmed using Bacillus subtilis mrpA and mrpD deletion strains that were more salt and pH sensitive than wild type cells, but to a different extent.



Recent work by Julia Steubers group at ETH Zürich showed that Complex I from Escherichia coli could translocate Na+, but this has hitherto not been regarded as a general property of proton pumping Complex I. By expressing the Complex I subunits NuoL and NuoM from the alpha-proteobacteria Rhodobacter capsulatus in the B. subtilis deletion strains we have demonstrated that these subunits are capable of Na+ translocation in vivo. Since R. capsulatus Complex I is more closely related to mitochondrial Complex I than to the E. coli enzyme, it is very likely that all Complex I enzymes have the ability to translocate Na+ as well as H+.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Evolusjon og energikonservering i en katalysator i cellens kraftverk



Alle levende organismer må omforme energien i mat eller sollys til en form som cellen kan bruke som energi. Energien brukes både til prosesser som bryter ned og bygger opp komponenter i cellen. Den brukes også til prosesser som muskelsammentrekninger, celledelinger og bevegelser. Uansett hva slags celle det er, en bakterie, gjærcelle, plantecelle eller dyrecelle, så løses energietterspørselen på omtrent samme måte. Denne avhandlingen handler om en av de biologiske maskiner, eller katalysatorer, som er med på denne energi konserveringsprosess. Energiformen alle celler spør etter heter ATP, som ofte også kalles cellens frie valuta.



Celler - den minste formen for liv



Celler som gjær-, plante- og dyreceller har forskjellige deler i seg der ulike prosesser fåregår. Organeller er en slik del av cellen som former en egen innesluttet enhet. Mitokondrie heter den organellen som produserer ATP og den kalles derfor cellens kraftverk. Dette kraftverket (og alle andre prosesser i cellen) drives av biologiske katalysatorer, som kalles enzymer. Forskjellige typer celler har ulikt antall mitokondrier avhengig av hvor mye energi de trenger. Muskelceller i hjertet for eksempel har mange hundre, mens en hudcelle bare har noen få.



Atomer - minste enhet i alle grunnstoff



Alt materiale rundt oss er bygget opp av en type byggesten som i natur-vitenskapen kalles atomer. Alle typer atomer består av en positivt ladet kjerne og små negativt ladde elektroner, e-, som sirkler rundt denne kjernen. Man får for-skjellige atomer ved å ha ulikt antall ladninger. Når et atom har ekstra positiv eller negativ ladning i forhold til grunnformen så kalles atom formen et jon. Når flere atomer binder seg sammen, like eller ulike, kalles de et molekyl. Man skiller molekyler i to hovedgrupper, biologisk nedbrytbare (organiske) og ikke biologisk nedbrytbare (uorganiske). Organiske molekyler har alltid en base av karbon (C) og andre vanlige atomer i organiske molekyler er hydrogen (H) og oksygen (O). I uorgan-iske molekyler finnes det for eksempel atomer som fosfor (P) og jern (Fe). Sistnevnte er også et metall som per definisjon er god til å lede e-, det vi opplever som varme. Noen molekyler du godt kjenner til er vann (H2O), oksygen (O2) eller rust (Fe2O3). Litt mer komplekst blir det om man skriver molekylformelen for energi valutaen ATP (det organiske molekylet adenosine trifosfat), som er C10H14N5O13P3.



Proteiner – cellens maskiner



Alt levende materiale, eller celler, er bygget opp av organiske molekyler, og en felles byggesten i alle cellens maskiner (proteiner) er aminosyrene, enten proteinene er signaloverførere eller enzymer. Aminosyrene har en felles grunnstruktur, men får ulike kjemiske egenskaper ved at en del av molekylet varierer fra en aminosyre til en annen. Man kan blant annet skille på om de liker vannrike miljøer (hydrofile aminosyrer), eller slettes ikke (hydrofobe aminosyrer). Proteiner er organiske konstruksjoner og innslag av metall som Fe kan være avgjørende for et enzyms funksjon, som egenskapen til å lede fram e- og å skape kjemiske reaksjoner.



Energi kan omvandles til mange former men aldri forsvinne



ATP, cellens energivaluta, inneholder tre fosfatgrupper, og om den ytterste frigjøres og overføres til en annen forbindelse, så mister ATP litt energi mens mottakeren blir mer energirik. Et annet alternativ er at energien frigjørs som varme, men energien forsvinner uansett aldri, den bare endrer form.



Molekyler i cellen kan også bli energirike ved å bygge seg opp et stort potensial til å gi fra seg e- (donor). Et molekyl med mindre slikt potensial tar gjerne imot e- (akseptor). Ved en slik reaksjon sier man sier at donoren blir oksidert og at akseptoren blir redusert, og at reaksjonen i seg er en redoks reaksjon. Et annet alternativ er at energien frigjøres som varme som utnyttes av omgivelsene.



Respirasjonskjeden – cellens energiproduksjon



Mitokondrien er som sagt cellens kraftverk, og den er sluttstasjonen for oppbyggingen av slike komponenter som gjerne gir fra seg e-. I den innerste av mitokondriens to vegger sitter det en hel rad av forskjellige enzymer, som fanger inn både e- donor og akseptor for hver sin reaksjon. Enzymene har også flere metallsentre i seg som hjelper e- til å finne rett vei fra donor til akseptor, for e- i seg klarer ikke å hoppe lange stykket. Inne i celleveggene er det et vannfritt miljø, og enzymene som sitter her er derfor hydrofobe proteiner. Enzymet denne avhandlingen handler om heter NADH:quinon oxidoreduktase (Complex I). Etter dette enzymet er det to enzymer til som hjelper til med e- transporten, og prosessen kalles også elektrontransport kjeden. Det siste transportenzymet har oksygen som sluttakseptor av e- og derfor er også navnet respirasjonskjeden brukt for denne prosessen.



I alle enzymer i kjedens kobles energien frigjort i e- transporten til en overforing av positivt ladede hydrogen atomer (H+). Når H+ transporteres fra midten av mitokondrien til mellom dens to vegger så dannes det en konsentrasjonsforskjell, en proton (H+) gradient. Dette er ennå en form for energi og en måte å konservere den på. Protongradienten brukes av enzymet som setter sammen (syntetiserer) det energirike molekylet ATP.



Celler finnes i to former



DNA, eller arevestoff, inneholder informasjonen om hvordan og når proteinene skal bygges opp. De cellene som har DNA innkapslet i en kjerne og har organeller heter eukaryoter. Bakterier kalles prokaryoter, de har et fritt DNA og ingen organeller, men de fundamen-tale biokjemiske prosessene som foregår er som oftest de samme som i eukaryotene. Det er faktisk fra bakterier som modellsystemer at vi har lært det meste om hvordan for eksempel energi-konserveringen i celler foregår. Mito-kondrien har som sagt to cellevegger og faktisk også sin egen bit sirkulært DNA og ligner dermed mye på en bakterie. Man tror også at mitokondrien oppstod ved at en type bakterie slo seg sammen med en forgjenger til den eukaryote bakterien. Siden både visse bakterier og mitokondrier har så like energi-produksjons systemer så kan man lære mye av å studere bakteriens enzymer. I denne avhandlingen er det også en liten rosa bakterie, av samme type som trolig er forgjengeren til mitokondrien, som er modellsystemet for Complex I.



Mitokondrien – nøkkelen til cellens liv og død



Den lille delen av arvematerialet som ligger inne i mitokondriene inneholder gener som koder for de membran-bundne delene av enzymene i respira-sjonskjeden. Siden DNA molekylet er fritt i organellen er det heller ikke beskyttet mot reaktive biprodukter som dannes under ATP produksjonen. Biproduktene er oksidanter som lett reagerer med molekyler i omgivelsene, både proteiner (enzymene selv) og DNA. Enzymene blir ødelagt, og ennå verre,



genene, som er grunnlaget for hvordan nye enzymer bygges opp, kan bli endret så de fungerer dårligere eller ikke i det hele tatt. Men mutasjoner er ikke nødvendigvis et onde, av og til bidrar de til forbedringer i et proteins funksjon, og de er faktisk årsaken til all evolusjon. Men akkurat her inne i mitokondrien gjør mutasjonene oftest mer skade enn gagn. Du har kanskje hørt om antioksidanter? Det er molekyler som tar seg av (reagerer med) de oksiderende forbindelsene så de ikke kan gjøre noen skade. C vitamin er en antioksidant, så spis mange appelsiner i påsken!



Mutasjoner i mitokondrielt DNA skaper en ond sirkel der enzymene fungerer dårligere og dårligere (for de fornyes hele tiden under cellens liv) og dermed også skaper mer reaktive oksidanter. Resultatet ser vi med årene på celler/organ som behøver mye energi, muskler, som de i hjertet, hjernen og øynene. Det kalles aldring. Men i visse fall så er mutasjonene koblet til spesifikke sykdommer, som Alzheimers og Parkin-son. Det finnes også arvelige mitokondri-elle sykdommer som for eksempel gir muskelsvikt elle blindhet i tidlig alder. Mer kunnskap om det enzymet som fortsatt kalles ”den svarte boksen” blant forskere på området, er viktig både for grunnleggende vitenskap og for medisinske aspekter.



Avhandlingen du sitter med i hånden bidrar med utfyllende kunnskap om hvor deler av Complex I har sine evolusjonære røtter, noe som er bra å vite for å forstå mer av enzymets mekanismer. Den gir nye detaljer om hvilken måte proteinet folder seg og viser at enzymet i sin rolle som energi konservator kan overføre Na+ og ikke bare H+.

• author: Mathiesen, Cecilie
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Prof. Friedrich, Thorsten, Albert-Ludwigs-Universitaet, Institut für Org. Chemie und Biochemie, Freiburg, Federal Republic of Germany.
• organization: Biochemistry and Structural Biology
• publishing date: 2003
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Biological Sciences
• keywords: Metabolism, Biokemi, metabolism, Biochemistry, mrp, electron transport, respiration, membrane protein
• pages: 150 pages
• defense location: Kemicentrum, Sal A, Getingevägen 60, Lund
• defense date: 2003-05-23 10:30:00
• ISBN: 91-7422-020-9
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Article: I. Transmembrane topology of the NuoL, M and N subunits of NADH:quinone oxidoreductase and their homologues among membrane-bound hydrogenases and bona fide antiporters.Mathiesen, C. and Hägerhäll, C. Biochim. Biophys Acta (2002). 1556:121-132. Article: II. The "antiporter module" of respiratory chain Complex I includes the MrpC/NuoK subunit - a revision of the modular evolution scheme. Mathiesen, C. and Hägerhäll, C. (2003). FEBS-Letters, submitted. Article: III. The Complex I subunits NuoL and NuoM from Rhodobacter capsulatus exhibit Na+ translocation ability in vivo.Mathiesen, C. and Hägerhäll, C. (2003). Manuscript. Article: IV. Expression and purification of his-tagged NuoL subunit from Rhodobacter capsulatus Complex I in Escherichia coli.Mathiesen, C., Eek, M. and Hägerhäll, C. (2003). Manuscript.
• id: 04ba07f0-be7e-4770-bd9e-084b95feb27d (old id 465751)
• date added to LUP: 2016-04-04 10:49:53
• date last changed: 2018-11-21 21:01:01