Advanced

Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation in the Application to Biological Macromolecules

Arfvidsson, Cecilia LU (2003)
Abstract (Swedish)
Popular Abstract in Swedish

I denna avhandling presenteras tillämpningar av separationsmetoden asymmetrisk flödes fältflödesfraktionering (AsFlFFF) på biologiska makromolekyler. Många svåra ord redan i den första meningen? Nedan följer en populärvetenskaplig sammanfattning, avsedd att ge ”hobby-vetenskapsmannen” en inblick i avhandlings-området. Här beskrivs kortfattat, den i avhandlingen utnyttjade tekniken, AsFlFFF, samt de två biologiska makromolekylerna, veteproteinet glutenin och ribosom-partikeln, som utnyttjats för att vidareutveckla användbarheten av AsFlFFF. Slutligen presenteras resultatet av avhandlingsarbetet - AsFlFFF som ett värdefullt verktyg i produktionen av exempelvis läkemedelsproteiner samt i... (More)
Popular Abstract in Swedish

I denna avhandling presenteras tillämpningar av separationsmetoden asymmetrisk flödes fältflödesfraktionering (AsFlFFF) på biologiska makromolekyler. Många svåra ord redan i den första meningen? Nedan följer en populärvetenskaplig sammanfattning, avsedd att ge ”hobby-vetenskapsmannen” en inblick i avhandlings-området. Här beskrivs kortfattat, den i avhandlingen utnyttjade tekniken, AsFlFFF, samt de två biologiska makromolekylerna, veteproteinet glutenin och ribosom-partikeln, som utnyttjats för att vidareutveckla användbarheten av AsFlFFF. Slutligen presenteras resultatet av avhandlingsarbetet - AsFlFFF som ett värdefullt verktyg i produktionen av exempelvis läkemedelsproteiner samt i storlekskarakteriseringen av världens kanske största protein.



Kemi



Inom naturvetenskapen är kemi ett mycket omfattande ämnesområde som vidare kan delas upp i ett antal delområden. Analytisk kemi är ett av de största och mest grundläggande delområdena.



Analytisk kemi – vad är det?



Oavsett delområde måste samtliga kemister analysera och studera sina slutresultat, vilket gör analytisk kemi till en av grundpelarna inom kemin. För att kunna studera en enskild substans måste denna oftast separeras från andra liknande substanser i en blandning. En lämplig separationsmetod, som kan urskilja de små skillnader som existerar mellan den intressanta substansen och andra substanser i exempelvis en lösning, måste således finnas. Några av de egenskaper som ofta utnyttjas för att åstadkomma en separation är substansernas storlek, form, laddning, kokpunkt och löslighet. Förutom att isolera den intressanta substansen från andra liknande substanser måste den också kunna detekteras, dvs. identifieras, med hjälp av en detektionsmetod för att bestämma mängden av (kvantifiera) substansen samt för att bestämma några av dess specifika egenskaper (kvalitativt karakterisera), oftast dess exakta storlek och vikt. Huvuduppgiften för en analytisk kemist är således att för varje ny situation finna den mest lämpliga separations- och detektionsmetoden för att kvantitativt och kvalitativt studera en substans. I denna avhandling har separationsmetoden asymmetrisk flödes fältflödesfraktionering (AsFlFFF) använts för att kvantitativt och kvalitativt studera biologiska makromolekyler.



Separationen som ett tävlingslopp



Separationen inom analytisk kemi kan på många sätt liknas vid ett tävlingslopp, exempelvis ett cykellopp. De tävlande cyklisterna motsvarar då kemiska substanser, samtliga väl samlade vid startlinjen. Tävlingsbanan eller cykelvägen är separations-metoden som separerar cyklisterna/substanserna efter skillnader i deras egenskaper. Cykeln, däckkvalitén och cyklisternas dagsform är egenskaper liknande de kemiska och fysikaliska egenskaperna hos kemiska substanser som kommer att påverka i vilken ordning de passerar mållinjen. I de fall då inga skillnader i egenskaper existerar måste något sorts hinder introduceras på vägen/i separationsmetoden som tvingar en av cyklisterna/substanserna att sakta ner. Domaren vid mållinjen motsvarar slutligen detektorn som registrerar ordningen på substanserna då de passerar.



Vad är en makromolekyl?



Dagens högteknologiska samhälle ställer höga krav på tillgång till vaccin, förbättrade läkemedel och förädlade livsmedelsprodukter. Detta har lett till en explosionsartad ökning av den biokemiska och biotekniska industrin i världen. Det har också resulterat i ett ökat intresse för biologiska substanser, framför allt biologiska makromolekyler, som många av de viktiga komponenterna i biologiska system t.ex. proteinkomplex, DNA och cellorganeller, representerar. Som namnet antyder (makro = stort) kan dessa molekyler, som är i storleksordningen (1 – 50) µm, i jämförelse med andra biologiska substanser likställas med vattenmelonen i en stor fruktkorg; större än äpplet och apelsinen (exempelvis mindre protein, 10-500nm) och betydligt större än plommonet och den lilla vindruvan (exempelvis peptider, små delar av ett protein, <10nm). Trots det stora intresset för biologiska makromolekyler och att det idag finns en mängd olika separationsmetoder minskar tillgången på en lämplig separationsmetod snabbt då storleken på substansen ökar. Detta beror bland annat på att separationsmetoden kan bryta ner, eller på annat sätt förstöra, den stora molekylen. För makromolekyler är tillgången på separationsmetoder därför starkt begränsad. Nya, alternativa separationsmetoder för dessa substanser är således eftertraktade.



Molekylvikt & molekylviktsfördelning



En ofta intressant egenskap hos en substans att bestämma är dess storlek eftersom denna i sin tur påverkar många andra egenskaper hos substansen, exempelvis dess stabilitet och löslighet. En substans storlek anges av kemister gärna i storheten molekylvikt eller molmassa, vars enhet är gram per mol (g/mol). En mol definierades redan på de gamla grekernas tid, av en man vid namn Avogadro, som 6 x 1023 st molekyler. En substans molekylvikt anger således vad en mol, eller 6 x 1023 molekyler, av denna substans väger. För mer komplexa substanser, till exempel många biologiska makromolekyler, anges ofta molekylvikten hellre som en molekyl-viktsfördelning. Detta beror på att substansen i fråga inte består av en enda molekylvikt (monodispersiv) utan av en blandning av olika molekylvikter (polydispersiv). Antag som jämförelse att människan är en biologisk makromolekyl. Alla människor väger då inte exakt lika mycket utan vikten varierar över ett större intervall. Andelen människor inom varje viktklass kan då ses motsvara andelen av respektive molekylvikt som finns i en substans dvs. substansens molekylvikts-fördelning. Detta ska jämföras med hela mänsklighetens medelvikt som motsvarar substansens medelmolekylvikt. Det är ofta av större intresse att kunna bestämma denna molekylviktsfördelning för substansen, än att bara erhålla dess medelmolekyl-vikt, eftersom molekylviktsfördelning också kraftigt påverkar substansens egenskaper och säger mycket mer om provet än dess medelmolekylvikt. Detta kräver dock att samtliga molekylvikter i substansen separeras från varandra innan respektive halt kan bestämmas. För detta ändamål krävs en separationsmetod som kan separera molekyler inom hela molekylviktsintervallet, något som ofta kan vara svårt att finna.



Fältflödesfraktionering – en mycket lämplig separationsmetod för makromolekyler



De flesta tillgängliga separationsmetoder för biologiska makromolekyler kräver mycket långa analystider och specifika separationsbetingelser, två egenskaper som ej är kompatibla med den effektiviserade och vinsttänkande industrin. I denna avhandling har därför en relativt ny, alternativ metod för storleksseparation och karakterisering av makromolekyler använts, asymmetrisk flödes fältflödesfraktionering (AsFlFFF). Denna separationsmetod har ett mycket brett användningsområde och är kapabel att storleksseparera substanser av makromolekylstorlek, samtidigt som den tillfredsställer industrins behov av flexibilitet och snabbt erhållna resultat. Dess milda påverkan på de substanser som separeras gör dessutom metoden speciellt användbar vid analys av känsliga biologiska makromolekyler.



Separationsprincipen i flödes FFF - diffusion



Den egenskap som utnyttjas för separation i AsFlFFF är substansers diffusion, eller egenrörelse. Diffusion kan ses som varje molekyls strävan att fördela substansen så jämnt som möjligt över hela den tillgängliga volymen. Ett bra exempel på diffusion är tillsatsen av ett par droppar koncentrerad citronsaft i en karaff med vatten. En kort stund efter tillsatsen har de små ”citronmolekylerna” i de koncentrerade dropparna spritt sig ut i vattnet för att upphäva koncentrationsskillnaden mellan dropparna och resten av karaffinnehållet. Ganska snart har dropparna diffunderat ut i hela vätskevolymen och vi har en karaff med citronvatten där citrontillsatsen är jämnt fördelad i hela karaffen.En liten substans rör sig lättare och snabbare i förhållande till sina grannsubstanser jämfört med en stor substans. Små substanser har därför en kraftigare diffusion än stora substanser och det är detta storleksberoende i diffusionen som utnyttjas för separation i AsFlFFF.



Separationsverktyget - FFF-kanalen



Separationen i AsFlFFF sker i en tunn (100-200 mm) kanal genom vilken ett flöde med parabolisk flödesprofil, dvs. flödeshastigheten är högst i mitten av kanalen och avtar därefter ut mot väggarna, pumpas. Kanalen bildas av ett 100 – 200 µm tjockt plastmellanlägg som har kanalformen utskuren i plasten. Detta mellan-lägg pressas mellan två plana väggar: den övre väggen består av en glasplatta medan den nedre är ett semipermeabelt membran som tillåter genomflöde av icke-prov-innehållande vätska, så kallad bärarvätska, men inte av provsubstans. Detta innebär att det ingående flödet till kanalen delas upp i två flöden, ett axiellt flöde som transporterar provsubstanserna genom kanalen samt ett korsflöde, vinkelrätt mot det axiella flödet, som påverkar samtliga provsubstanser med en nedåtriktande kraft och pressar substanserna mot membranet.



Separationen i FFF-kanalen



Den nedåtriktade kraften (korsflödet) på provsubstanserna motverkas av deras diffusion i ett försök att utjämna den förhöjda koncentrationen av provmaterial vid membranet. Eftersom substanser av olika storlek också har olika diffusion kommer deras förmåga att motverka den nedåtriktade kraften att variera med storleken. Vid jämvikt mellan de två motstående krafterna erhåller varje substans ett medelavstånd från membranet som är direkt relaterad till dess diffusion. En liten substans, med kraftigare diffusion, får ett längre medelavstånd från membranet än en stor substans. På grund av den parabola flödesprofilen påverkas därför en liten substans av en kraftigare axiell flödesvektor och transporteras fortare genom kanalen än en stor substans. Provsubstanserna separeras således och lämnar kanalen efter ökad storlek.



Glutenin och ribosompartikeln – två biologiska makromolekyler



I denna avhandling har de två biologiska makromolekyler, glutenin och ribosom-partikeln, använts för att vidareutveckla användbarhet av AsFlFFF vid separation och karakterisering av biologiska makromolekyler.



Glutenin – viktig för en degs jäsegenskaper



Glutenin har påståtts vara världens kanske största protein. Proteinet är en biologisk makromolekyl, vars närvaro i vetemjöl starkt påverkar mjölets jäsegenskaper. Under jäsning av en vetedeg bildar glutenin en matris mellan degens stärkelsekorn och gasbubblor, vilket ger degen dess elastiska och luftiga egenskaper. Mängden glutenin i ett vetemjöl påverkar därför kraftigt dess jäsegenskaper. Ett mjöl med hög halt av glutenin har således bättre bakegenskaper än ett mjöl med låg halt glutenin. För att vidare kunna koppla glutenins kemiska egenskaper till dess funktion i vetemjöl och öka förståelsen kring varför just dessa egenskaper ger degen sin utformning måste dessa kemiska egenskaper karakteriseras. Av största vikt är då bland annat att kunna bestämma glutenins molekylvikt och molekylviktsfördelning. På grund av dess storlek har denna karakterisering tidigare varit svår eftersom de flesta separationstekniker har en övre molekylviktsgräns som ligger långt under den för glutenin uppskattade molekylvikten. Då en övre molekylviktsgräns i princip saknas i AsFlFFF är denna separationsteknik väl anpassad till att användas vid karakterisering av glutenin. I denna avhandling har AsFlFFF därför utnyttjats för att bestämma molekylvikten och molekylvikts-fördelningen för glutenin. Eftersom glutenin, på grund utav sin storlek, är svårlösligt i vatten har dessutom två olika upplösningsmetoder och deras påverkan på molekylvikten studerats. Slutligen har glutenin också använts för att öka förståelsen för hur makromolekyler, med sina ofta höga molekylvikter, uppför sig i FFF-kanalen, eftersom detta ofta avviker från det ”normala” beteendet.



Resultatet av gluteninstudierna



Med hjälp av AsFlFFF, i kombination med en absolut detektionsmetod, kunde glutenins molvikt och molviktsfördelning bestämmas till en av de högsta i världen, med god noggrannhet. Proteinet visade sig innehålla molekylvikter upp mot 1 miljard med en medelmolekylvikt runt 30 miljoner. Vid jämförelse av de två upplösningsmetoderna, omrörning och ultraljud, kunde det också påvisas att upplösning med hjälp av ultraljud innebar en viss nedbrytning av proteinet med en lägre medel-molekylvikt som följd. Om det obrutna hela proteinet ska studeras är således upplösning med hjälp av omrörning det enda lämpliga alternativet att använda.



Ribosomen – proteinfabriken i alla celler



En cell innehåller flera beståndsdelar som, i likhet med organen i vår kropp, har olika funktioner i cellen. Ett av dessa ”organ” är ribosomen, en biologisk partikel som det finns ett mycket stort antal av i cellen. Ribosomens funktion är att producera protein varför den kan ses som proteinfabriken i alla biologiska celler. Den består av två enheter, den så kallade stora respektive lilla subenheten. Dessa subenheter simmar fritt omkring i cellen men slås ihop till den hela aktiva ribosomen då proteinproduktionen startar. Ribosomens viktiga funktion i cellers proteinproduktion har gett den ett nyvunnet intresse det senaste decenniet på grund av bioteknikens exponentiella tillväxt.



Ribosomen – en viktig komponent i framtidens bioteknik?



Ordet bioteknik är ett ofta omnämnt begrepp i dagens massmedia och är ett begrepp som inte sällan leder till debatt. Men vad är det egentligen? Bioteknik kan beskrivas som en process för odling av celler. Denna odling kan ske i allt från kubik-meterstora processtankar ute i industrin till små tankar på ett par deciliter på forskningslaboratorier. I vissa fall kan cellerna i sig vara av intresse men oftast är det proteinerna, som produceras i cellerna, som är det stora intresset. Produktionen av protein i en cell styrs av cellens arvsmassa, DNA. Cellens DNA finns effektivt lagrat som en kod av bokstäver i cellen och är de instruktioner som en cell erhållit vid sin bildning. Proteinerna kan ses som cellens maskineri som utför de uppgifter de programmerats för med hjälp av instruktionerna i cellens minne.



Varför bioteknik?



En av anledningarna till den bioteknologiska revolutionen är det ökade intresset för att använda genetiskt manipulerade biologiska celler inom framför allt läkemedelsindustrin och livsmedelsindustrin. Detta innebär att man går in i cellens arvsmassa och förändrar något i den för att på så sätt få nya, förbättrade egenskaper hos cellen. Ett vanligt förfarande är att få cellen till att producera ett industriellt eller farmaceutiskt värdefullt protein. Detta har fått en mycket stor betydelse i framför allt läkemedelsindustrin. Här finns det redan idag ett flertal exempel där tekniken utnyttjas t.ex. vid produktion av insulin, tillväxthormon, antibiotika, vaccin och mediciner för cancerterapi. Inom den andra stora industrin med biotekniska tillämpningar, livsmedelsindustrin, används tekniken för att förädla spannmål, växter och grönsaker för att få exempelvis frosttåliga tomater och extra söta jordgubbar. Det är kanske inom detta område som biotekniken stött på mest skepsis från allmänheten. Denna ibland mycket väl-motiverade skepsis beror ofta på rädsla inför att ”störa” det naturliga förloppet, men också på viss okunskap i området. Bioteknik och genteknik inom jordbruket har bland annat en enorm potential i kampen mot hungersnöden i utvecklingsländerna. Genom att få fram mer torktåliga och virusresistenta växter skulle många av de skördar som idag går förlorade i dessa länder kunna räddas.



Celler kräver en trivsam miljö för tillväxt



För att en cellodling ska vara ekonomiskt lönsam måste den drivas under förhållanden som ger en maximal proteinproduktion. Precis som vi människor behöver syre och vatten för den akuta överlevnaden och även mat och sömn för en längre överlevnad och trivsel kräver celler speciella förhållanden för att kunna producera proteiner med högsta effektivitet. De flesta vet exempelvis hur jästcellerna i en vetebrödsdeg mår om de inte får rätt ”fingervarma” temperatur att arbeta i. Förutom en trivsam temperatur kräver cellerna ofta syre, ett visst pH och de rätta tillsatserna av näringsämnen. Arbetet med att hitta den för cellen mest gynnsamma miljön är därför inte så lätt och dessutom mycket tidskrävande. Det finns således ett stort intresse för att, i likhet med att ta temperaturen på en människa för att se om hon mår bra, kunna sticka ner en ”termometer” i cellodlingen för att snabbt och kontinuerligt kunna få reda på hur cellerna mår och då hur bra den protein-producerande aktiviteten i cellerna är. I denna avhandling har därför en del av arbetet fokuserats på framtagning av en tänkbar ”termometer ” och vad den i så fall skulle mäta.



Proteinproduktionen avslöjar möjliga kvantiteter för ”termometern” att mäta



Vid behov av ett protein, exempelvis insulin för att reglera och ta hand om den förhöjda blodsockerhalten efter en måltid, stimuleras den lilla ribosomala subenheten till att finna den del av cellens DNA som beskriver koden för detta protein. Väl funnen, fäster subenheten på denna DNA-del samtidigt som den signalerar till den stora subenheten att proteinet ska produceras. Den stora subenheten ansluter då till den lilla subenhetens plats på DNA-molekylen och den hela aktiva ribosomen bildas, redo att starta proteinproduktionen. Produktionen av ett protein kan liknas vid hopsättningen av ett pärlhalsband, där det färdiga pärlhalsbandet motsvarar det färdiga proteinet. De minsta beståndsdelarna, eller byggstenarna, i ett pärlhalsband är de enskilda pärlorna som en efter en adderas till den redan färdiga kedjan tills halsbandet är komplett. I protein-produktionen finns motsvarande byggstenar till dessa pärlor i aminosyrorna. Dessa byggs på en efter en till den redan färdiga biten av proteinet, efter hand som ribosomen får instruktioner från DNA-molekylen om vilken aminosyra som ska byggas på. Ihopslagningen av de två subenheterna till den hela aktiva ribosomen, som startar proteinproduktionen, är det första kritiska steget i produktionen av ett protein. Det andra kritiska steget är transporten av rätt aminosyra till ribosomen. Denna transport sker med hjälp av ett transportmedel som kallas tRNA. Från beskrivningen i DNA-koden meddelar ribosomen tRNA-molekylen vilken aminosyra som ska byggas på till det växande proteinet, varpå denna transporterar den önskade aminosyran till ribosomen. En ”termometer” som mäter andelen hela aktiva ribosomer i cellen samt halten tRNA ger således ett bra mått på hur cellen mår och hur hög proteinproduktionen i cellen är, eftersom dessa båda kvantiteter är kritiska för en god proteinproduktion.



AsFlFFF – termometern



Med hjälp av AsFlFFF separeras ribosomen, subenheterna och tRNAt fullständigt från varandra vilket möjliggör en kvantitativ bestämning av respektive molekyl genom att helt enkelt jämföra arean under respektive topp. Valet av AsFlFFF som termometer innebär således att flera mått på hur proteinproduktionen i cellen är kan mätas i ett enda experiment.



Resultatet av ribosomstudierna



I denna avhandling har användningen av AsFlFFF som en ”termometer” möjliggjorts genom utvecklingen av en tidsminimerad preparation och separation av de ribosomala substanserna. Tiden för preparation av ribosomalt material har minskats från 1 timme och 40 min till 8 min medan separationen minskats från 8 min till 6 min. Denna tidsminimering möjliggör en kontinuerlig uppdatering i hur den ribosomala sammansättningen i en proteinproducerande cell förändras efter hand som odlingen och celltillväxten fortgår. Kopplingen mellan cellers tillväxthastighet och dess ribosomala sammansättning har också påvisats i avhandlingen med hjälp av den utvecklade metoden. Detta innebär att det nu finns goda förhoppningar om att AsFlFFF ska kunna utvecklas till den ”termometer” som söks, ett värdefullt redskap i utvärderingen av proteinproduktionen i celler som producerar industriella eller farmaceutiska proteiner. En första applicering av metoden vid utvärdering av en bioprocess har slutligen gjorts genom att studera ribosomsammansättningen i proteinproducerande celler. (Less)
Abstract
Asymmetrical flow field-flow fractionation (AsFlFFF) is especially useful in the application to biological macromolecules due to the absence of a stationary phase in the separation channel. As a result no upper exclusion limit occurs and low shear forces affect the sample components. In addition, native condition, most suitable for the samples analysed, can be used since no consideration has to be taken to a stationary phase. Due to the last decade’s increased interest in biological science and biological macromolecules new separation systems, well suited for fast and cost-efficient quantitative and qualitative characterisations, are in high demand. In this thesis the suitability of AsFlFFF in the separation and characterisation of... (More)
Asymmetrical flow field-flow fractionation (AsFlFFF) is especially useful in the application to biological macromolecules due to the absence of a stationary phase in the separation channel. As a result no upper exclusion limit occurs and low shear forces affect the sample components. In addition, native condition, most suitable for the samples analysed, can be used since no consideration has to be taken to a stationary phase. Due to the last decade’s increased interest in biological science and biological macromolecules new separation systems, well suited for fast and cost-efficient quantitative and qualitative characterisations, are in high demand. In this thesis the suitability of AsFlFFF in the separation and characterisation of biological macromolecules was demonstrated by two biological macromolecules in need of new separation methods – the ultra large wheat protein glutenin and the ribosomal particles, involved in the protein synthesis. AsFlFFF was proven to be a fast alternative to ultracentrifugation in the separation of ribosomal particles. A correlation between cell growth and ribosomal composition was established. Using a time-minimised ribosome preparation high frequency, at-line determinations, of ribosome and tRNA levels in cell cultures during cultivation, were made possible. This resulted in the complete ribosome and tRNA profiles, as well as evidence for the 100S ribosomal particle in the exponential growth phase. The AsFlFFF method displayed its usefulness for at-line monitoring during recombinant protein production. AsFlFFF connected to multiangle light scattering (MALS) detection, in combination with refractive index (RI) detection, enabled the complete molecular weight distribution as well as the weight average molecular weight of glutenin to be determined. Molecular weights above 108 were observed and the average weight average molecular weight was (2 – 3) x 107. The AsFlFFF-MALS-RI combination was also used to illustrate the impact on the physical breakdown of the glutenin molecules when using sonication to dissolve glutenin, compared to when using gentle stirring. Finally the nonideal behaviour of ultra-large macromolecules in the AsFlFFF channel, exemplified by the glutenin, was carefully investigated and minimised. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
opponent
  • Dr Williams, Kim R., Chemistry and Geochemistry Department, Colorado School of Mines, Golden CO, USA
organization
publishing date
type
Thesis
publication status
published
subject
keywords
Analytical chemistry, Analytisk kemi, Bioteknik, Biotechnology, biotechnology, recombinant protein production, molecular weight, Escherichia coli, ribosomes, glutenin, asymmetrical flow field-flow fractionation, multiangle light scattering
pages
322 pages
publisher
Cecilia Arfvidsson, Department of Technical Analytical Chemistry, Center for Chemistry and Chemical Engineering
defense location
Lecture hall C at the Center for Chemistry and Chemical Engineering, Sölvegatan 39, Lund Institute of Technology
defense date
2003-06-05 10:30
ISBN
91-628-5621-9
language
English
LU publication?
yes
id
175a9936-23fc-4e91-a22c-edf6a683947c (old id 465952)
date added to LUP
2007-10-13 13:54:13
date last changed
2016-09-19 08:45:09
@misc{175a9936-23fc-4e91-a22c-edf6a683947c,
  abstract     = {Asymmetrical flow field-flow fractionation (AsFlFFF) is especially useful in the application to biological macromolecules due to the absence of a stationary phase in the separation channel. As a result no upper exclusion limit occurs and low shear forces affect the sample components. In addition, native condition, most suitable for the samples analysed, can be used since no consideration has to be taken to a stationary phase. Due to the last decade’s increased interest in biological science and biological macromolecules new separation systems, well suited for fast and cost-efficient quantitative and qualitative characterisations, are in high demand. In this thesis the suitability of AsFlFFF in the separation and characterisation of biological macromolecules was demonstrated by two biological macromolecules in need of new separation methods – the ultra large wheat protein glutenin and the ribosomal particles, involved in the protein synthesis. AsFlFFF was proven to be a fast alternative to ultracentrifugation in the separation of ribosomal particles. A correlation between cell growth and ribosomal composition was established. Using a time-minimised ribosome preparation high frequency, at-line determinations, of ribosome and tRNA levels in cell cultures during cultivation, were made possible. This resulted in the complete ribosome and tRNA profiles, as well as evidence for the 100S ribosomal particle in the exponential growth phase. The AsFlFFF method displayed its usefulness for at-line monitoring during recombinant protein production. AsFlFFF connected to multiangle light scattering (MALS) detection, in combination with refractive index (RI) detection, enabled the complete molecular weight distribution as well as the weight average molecular weight of glutenin to be determined. Molecular weights above 108 were observed and the average weight average molecular weight was (2 – 3) x 107. The AsFlFFF-MALS-RI combination was also used to illustrate the impact on the physical breakdown of the glutenin molecules when using sonication to dissolve glutenin, compared to when using gentle stirring. Finally the nonideal behaviour of ultra-large macromolecules in the AsFlFFF channel, exemplified by the glutenin, was carefully investigated and minimised.},
  author       = {Arfvidsson, Cecilia},
  isbn         = {91-628-5621-9},
  keyword      = {Analytical chemistry,Analytisk kemi,Bioteknik,Biotechnology,biotechnology,recombinant protein production,molecular weight,Escherichia coli,ribosomes,glutenin,asymmetrical flow field-flow fractionation,multiangle light scattering},
  language     = {eng},
  pages        = {322},
  publisher    = {ARRAY(0x7e697c0)},
  title        = {Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation in the Application to Biological Macromolecules},
  year         = {2003},
}