Microfluidic biosensing systems based on enzymes, antibodies and cells

Abstract

The rapid developments within the life science and biotechnology areas put up ever-new demands on more sophisticated techniques and methods for chemical and biological analysis to reach deeper insight into the events at molecular level. Miniaturisation of assays and systems on microchips is one way to increase throughput and advance through parallel analysis lines, multiplexing and integration. This thesis shows some aspects on the use of silicon microchips as a platform for immobilisation of enzymes, antibodies and cells for chemiluminometric biosensing assays.



For antibody- and enzyme-based systems, special attention was paid to the immobilisation chemistry due to its influence on stability and activity of the attached biomolecules. In general it was found that surface coatings with a layer of polymer, e.g., polyethylenimine or dextran, increased both stability and signal intensity of the systems, compared to ordinary silanisation-based attachment chemistry.



Furthermore, two cell-based monitoring systems, using either yeast cells or a reporter gene modified human (HeLa) cell line, were developed. These systems demonstrated the usefulness and advantages of microfluidics, e.g. in continuous monitoring of cellular events in real time, which stands in great contrast to the common end-point microtiter plate assays. The demands on yeast compared to human cells are however quite different, where the latter has highly specialised requirements on the physical and chemical environment. Special attention was thus paid on investigating different factors that can lead to unspecific and stress-related expression of the reporter gene, hence affecting the quality of the data and overall performance of the system.



In conclusion, the main focus of this thesis has been to develop and apply analytical techniques and methods on microchips on flow-format. During the period the which this research was conducted, many interesting and elegant microfluidic analytical systems have been reported in the literature, however, the attention is often drawn mainly to the hardware set-up and construction. The systems developed in this thesis (paper I to V) are technically simple but show real applications in which biological elements, such as living cells, enzymes and antibodies, are handled on silicon microchips.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

<i>Kemister kallas de, som förstå att utreda hwad hwarje sak består utaf, och huru man af beståndsdelarne må kunna sammansätta nya ämnen. Kunskapen härom kallas Kemi. Den största Kemisten war wår landsman Jacob Berzelius, som föddes 1779 i Wäfwersunda i Östergötland och dog i Stockholm 1848.</i>



Så skriver N. J. Berlin i sin <i>Läsebok i Naturläran för Sweriges Allmoge</i> utgiven år 1852. Denna beskrivning är fortfarande sann, men i något modernare ordalag uttryckt så kan <i>kemi</i> beskrivas som vetenskapen om ämnens sammansättning, egenskaper och omvandlingar. Vetenskapen kemi är ett mycket omfattande område där det idag finns många olika delområden. Forskningen, som ligger till grund för denna avhandling, är lokaliserad inom delområdet <i>analytisk kemi</i>, som omfattar tekniker och metoder för att karaktärisera (analysera) kemiska föreningar, och blandningar av kemiska föreningar. Några enkla applikationer på vad man kan utföra med analytisk kemi är t.ex., att bestämma koncentrationen nitrit/nitrat i dricksvatten (intressant ur vattenkvalitetsperspektiv) eller glukos koncentrationen i blod (viktigt att känna till för diabetiker där glukoskoncentrationen i blodet är avgörande för hälsotillståndet). Även analytisk kemi kan delas in i olika delområden, antingen på basis av vad för typ av material som analyseras eller med vilken teknik som analysen utföres. Forskning inom analytisk kemi syftar till att utveckla nya tekniker samt att innovativt kombinera olika tekniker till att utgöra system för bättre problemlösning och kemisk analys.



Under de sista tio-tolv åren ser man en tydlig trend mot att utveckla miniatyriserade system för kemisk analys på små mikrochips, tillverkade i kisel, glas eller plast. Tillverkningsteknikerna är ursprungligen hämtade från mikroelektronikindustrin där de används för att tillverka elektroniska mikrochips för t.ex. datorer. På mikrochipsen för kemisk analys finns det istället för koppartrådar (som leder elektrisk ström), kanaler och reaktionskamrar, i vilka vätska transporterar prover och reagens för att utföra kemisk analys. Kanalerna är vanligen mellan 10 och 100 µm (1 µm är 0,000001 m) i tvärsnitt och dimensionerna på mikrochipen är ofta några, upp till ett tiotal kvadratcentimeter stora. Jämfört med ordinär kemisk analysutrustning och teknik vill man med mikrochipminiatyriseringen reducera de fysiska dimensionerna i de steg där vätska, reagens och prov hanteras, transporteras och reagerar. Orsaken till detta intresse är tvåfaldig: analytiskt-kemiskt-tekniskt intressanta effekter från miniatyrisering (däribland förbättrad kvalitet och snabbare analys) samt ekonomiska fördelar. Dessa två är dock intimt relaterade till varandra, t.ex. kan förbättrad och snabbare analys via miniatyrisering ge högre genomströmning av prov per tidsenhet, vilket kan vara ekonomiskt gynnsamt. Vidare, så är en praktisk konsekvens av miniatyrisering att kemikalie- och energikonsumtion minskar, vilket är både ekonomiskt och miljömässigt fördelaktigt.



Syftet med den forskning, som ligger till grund för denna avhandling, har varit att utveckla och undersöka potentialen med miniatyriserade system, där nyckel-komponenten för mätningen är en biologiskt aktiv komponent, t.ex. en antikropp (artikel I och II), ett enzym (artikel III och IV) eller en levande celler (artikel IV och V). En typ av mikrochips som använts var tillverkad i kisel med ett parallellt kanalverk i vilket vätska med reagens och prov pumpas. På mikrochipens yta binds de biologiska komponenterna fast på kemisk väg (processen kallas immobilisering) och innebär att dessa kan återanvändas; detta är kostnadseffektivt eftersom både enzym och antikroppar är dyra kemikalier. Enzym och antikroppar är mycket stora molekyler som finns i alla levande organismer där de är involverade i olika kemiska processer; antikroppar deltar i immunförsvaret och enzymer katalyserar kemiska reaktioner (d.v.s. gör så att de sker snabbare). Båda dessa grupper av biologiska molekyler har en förmåga att kunna binda speciellt med vissa ämnen eller grupper av ämnen. Detta kan utnyttjas för kemisk analys genom att t.ex. låta antikroppars specifika bindning "fiska ut" det man är intresserad av ur en blandning. En stor fördel med denna "biologiska specificitet" är att provet ofta inte behöver renas upp före analys, vilket annars skulle kräva både kostsamma och tids-ödande procedurer. På liknande sätt kan enzym utnyttjas där detta endast katalyserar reaktionen med de ämnen som kan binda specifikt till det. De enzym- och antikroppschip som utvecklats i det här arbetet har först karaktäriserats genom att analysera prov med känd sammansättning, och därefter har prov med okänd koncentration analyserats för att bestämma deras innehåll. För antikropp- och enzymchipsen ägnades mycket stor uppmärksamhet åt att bestämma hur immobiliseringskemin (det sätt på vilket molekylerna var fastbundna till ytan) påverkade de biologiska molekylernas stabilitet och aktivitet. Dessa egenskaper är viktiga att känna till för att kunna erhålla tillförlitliga data. Miljön på mikrochipsen är väldigt olik den som antikroppar och enzym härstammar ifrån (d.v.s. inuti levande organismer) och blir därigenom lätt förstörda om de inte hanteras på rätt sätt. Genom att använda olika tillvägagångssätt och reagens vid immobiliseringsproceduren kan ett mikroklimat skapas runt de biologiska molekylerna på mikrochipsen som gör att de blir stabilare under en längre tid. Vilken immobiliseringsmetod som leder till en, för biomolekylerna, gynnsam miljö är inte lätt att i detalj förutse utan måste utvärderas experimentellt.



Levande celler kan också användas som nyckelkomponent i ett system för kemisk analys. Systemet blir då mer komplext och informationen som erhålls är oftast inte koncentrationen av ett sökt ämne utan istället t.ex. giftighet (toxicitet), biologisk tillgänglighet och/eller biologisk aktivitet. Beroende på vilken typ av celler som systemet är baserat på kommer informationen att variera. I det här arbetet utvecklades två modellsystem, först med jästceller (artikel IV) och sedan med en human cancer-cellstam kallad HFF11 (artikel V). Målet var här att visa möjligheterna, men också svårigheterna, med att använda mikrochips som bas för ett cellbaserat analytiska system. Den initiala frågeställningen var om mikrochipsen kunde användas som en plattform för analys av levande celler och hur dessa skulle må i miljön på mikrochipen. Detta undersöktes först för jästceller eftersom dessa är robusta mikroorganismer (se artikel IV), och resulterade i positiva resultat. Nästa steg blev ett något mer komplext system och för detta valdes cellstammen HFF11 (se artikel V), vilken är genetiskt modifierad för att kunna användas för utveckling av nya läkemedel. Frågeställningen var liknande den för det föregående jästsystemet, men i jämförelse ställer HFF11-cellerna avsevärt högre krav på den fysiska och kemiska miljön de befinner sig i. Felaktigheter eller dramatiska förändringar i cellernas miljö kan leda till cellstress och ge upphov till icke-tillförlitlig data. Vidare är analystiden mycket längre, mellan 10 och 30 timmar, vilket skall jämföras med ca en till två timmar för jästcellerna. En stor del av arbetet ägnades därför åt att studera hur dessa celler påverkades av olika hanteringssätt, vilket slutligen resulterade i ett mikrosystem som kunde användas för att studera och följa cellernas aktivitet under ca 30 timmar.



Under den tid som det här arbetet har utförts har andra forskargrupper rapporterat om eleganta mikrochipssystem, men fokus har ofta legat på den tekniska konstruktionen och dess utförande. I denna avhandling har tekniskt sett relativt enkla system utvecklats, där tyngdpunkten lagts på utvärdering av hur olika biologiska komponenter beter sig i mikroformatet, vilket mer sällan har beskrivits i litteraturen.



Vad gäller framtidsutsikterna generellt så finns visioner om att ett helt laboratorium skall kunna rymmas på ett mikrochips, därav har begrepp som "laboratorie-på-ett-chip" eller "laboratoriechip" myntats. Detta innebär att analyser som det annars krävs ett helt laboratorium för att utföra skall kunna rymmas på ett litet mikrochip. På ett sådant laboratoriechips skall man kunna sätta en droppe prov (t.ex. blod, saliv, dricksvatten) som sedan portioneras ut via kanaler på chipet till små stationer där olika analyser utförs. Några minuter senare skall ett komplett resultat från analysen erhållas. Vidare är tanken att det inte skall behövas någon bred kemisk kunskap för att kunna hantera chipset, ungefär som persondatorernas "plug-and-play" system, som bara kräver att man trycker på startknappen. Laboratoriechipsen skall kunna ersätta tidsödande rutinmässiga analyser som idag utförs med manuell hantering, involverar flera personer och transport mellan olika enheter där separata analyser sker. Ett exempel är alla de kliniska analyser som idag sker där prov tas från patienter vid olika vårdcentraler och sjukhus och som sedan transporteras till ett centralt laboratorium där analyserna sedan sker. Resultatet skickas sedan tillbaks till den lokala vårdpersonalen och slutligen görs bedömningen av patientens hälsotillstånd. Här skulle ett laboratoriechip direkt kunna hanteras av sköterskan eller läkaren ute på det lokala sjukhuset/vårdcentralen och inom en avsevärt kortare tid ge provresultaten för patienten ifråga. Man kan t.o.m. tänka tanken att framtidens patienter själv kontrollerar sitt hälsotillstånd, ungefär som en diabetiker idag kan kontrollera sin glukoskoncentration och därmed sitt behov av insulin.

• author: Davidsson, Richard
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Ruzicka, Jaromir
• organization: Centre for Analysis and Synthesis
• publishing date: 2004
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Analytical Chemistry
• keywords: Analytical chemistry, Analytisk kemi, chemiluminescence, immobilization, cell, antibody, enzyme, miniaturization, Microfluidic, microchip
• pages: 214 pages
• defense location: Lecture hall B, 10.15, 2004, Chemistry Center
• defense date: 2004-02-28 10:15:00
• ISBN: 91-7422-045-4
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Article: Paper I. Microfluidic enzyme immunoassay using silicon microchip with immobilized antibodies and chemiluminescence detection. J. Yakovleva, R. Davidsson, A. Lobanova, M. Bengtsson, S. Eremin, T. Laurell, J. Emnéus, Analytical Chemistry 2002, 74, 2994-3004. Article: Paper II. Microfluidic enzyme immunosensors with immobilised protein A and G using chemiluminescence detection. J. Yakovleva, R. Davidsson, M. Bengtsson, T. Laurell, J. Emnéus, Biosensors and Bioelectronics 2003, 19, 21-34. Article: Paper III. Microfluidic biosensing systems part I: Development and optimisation of enzymatic chemiluminescent µ-biosensors based on silicon microchips. R. Davidsson, F. Genin, M. Bengtsson, T. Laurell, J. Emnéus, submitted to Lab on a Chip. Article: Paper IV. Microfluidic biosensing systems part II: Monitoring the dynamic production of glucose and ethanol from microchip-immobilised yeast cells using enzymatic chemiluminescent µ-biosensors. R. Davidsson, B. Johansson, V. Passoth, M. Bengtsson, T. Laurell, J. Emnéus, submitted to Lab on a Chip. Article: Paper V. Developments towards a microfluidic system for long-term monitoring dynamic cellular events. R. Davidsson, J. Bristulf, K. Kotarsky, B. Olde, C. Owman, M. Bengtsson, T. Laurell, J. Emnéus, submitted to Analytical Chemistry, revisions requested. Article: Appendix of included papers Article: Paper A-I. Detection of Escherichia coli in water by culture-based amperometric and luminometric methods. C. Nistor, A. Osvik, R. Davidsson, A. Rose, U. Wollenberger, D. Pfeiffer, J. Emnéus, L. Fiksdal, Water Science and Technology 2002, 45, 191-199. Article: Paper A-II. A Chemiluminescence flow immunosensor based on a porous monolithic metacrylate and polyethylene composite disc modified with protein G. S. Rani Jain, E. Borowska, R. Davidsson, M. Tudorache, E. Pontén, J Emnéus, Biosensors and Bioelectronics 2003, in press. The information about affiliations in this record was updated in December 2015. The record was previously connected to the following departments: Analytical Chemistry (S/LTH) (011001004)
• id: 6cfd181e-4df1-426c-8913-79a515425a44 (old id 466691)
• date added to LUP: 2016-04-04 10:31:12
• date last changed: 2018-11-21 20:59:13