Advanced

Assessment of eosinophil degranulation in allergic diseases and experimental models

Malm-Erjefält, Monika LU (2004)
Abstract (Swedish)
Popular Abstract in Swedish

Den eosinofila granulocyten är en typ av vit blodkropp som ingår i kroppens immunförsvar. Vid allergirelaterade sjukdomar ses en ökad mängd av eosinofiler i blodbanan samt lokalt i den allergiskt inflammerade vävnaden. I vävnaden släpper eosinofilerna ut sina granulaproteiner som har celldödande, immunförsvarsreglerande och tillväxtfrämjande egenskaper. Hos patienter med allergiska sjukdomar som t ex. astma, hösnuva och atopiskt eksem sker denna granulaproteinfrisättning, dvs degranulering, via två olika mekanismer. I det ena fallet sker en gradvis minskning av eosinofilens granulainnehåll där proteinerna transporteras via små vesikulära strukturer till cellmembranet och vidare ut från cellen... (More)
Popular Abstract in Swedish

Den eosinofila granulocyten är en typ av vit blodkropp som ingår i kroppens immunförsvar. Vid allergirelaterade sjukdomar ses en ökad mängd av eosinofiler i blodbanan samt lokalt i den allergiskt inflammerade vävnaden. I vävnaden släpper eosinofilerna ut sina granulaproteiner som har celldödande, immunförsvarsreglerande och tillväxtfrämjande egenskaper. Hos patienter med allergiska sjukdomar som t ex. astma, hösnuva och atopiskt eksem sker denna granulaproteinfrisättning, dvs degranulering, via två olika mekanismer. I det ena fallet sker en gradvis minskning av eosinofilens granulainnehåll där proteinerna transporteras via små vesikulära strukturer till cellmembranet och vidare ut från cellen s.k. piecemeal degranulation. I det andra fallet sker en dramatisk frisättning av eosinofilens totala innehåll på grund av bristningar i cellmembranet vilket leder till celldöd (cytolys). Eftersom eosinofilinvandring och degranulering är karakteristiskt för allergiska tillstånd kan förändringar i eosinofilens cellstruktur vara en biologisk markör för sjukdomsprocessen i den inflammerade vävnaden och användas för att utvärdera olika farmakologiska behandlingar.



Med avseende på den upplösning och specificitet som behövs för att upptäcka strukturförändringar i eosinofilen krävs elektronmikroskopiska studier på cellorganellsnivå (s.k. ultrastrukturella studier). Trots att eosinofilens aktivering i olika biologiska system studerats intensivt är det få som har utfört ultrastrukturella studier. Därför finns ett stort behov att visa på och förklara uppkomsten och regleringen av eosinofildegranulering mer i detalj vid allergisk sjukdom, men också i de experimentella djur- och cellmodeller som används för att studera cellaktivering och den allergiska sjukdomsprocessen.



Den första studien i denna avhandling karakteriserar och beskriver eosinofilernas degranuleringsgrad i de vanligaste djurmodellerna använda för forskning om astma och hösnuva. För närvarande används framför allt möss som efter upprepad exponering med allergen får en astmaliknande eosinofilrik inflammation. Trots att dessa allergiska möss har en ökad mängd eosinofiler i luftvägsslemhinnan har aktiveringsgraden av dessa eosinofiler inte studerats i detalj, kanske beroende på att degranulering tagits för givet. I studie I görs även en jämförelse mellan blodeosinofiler från mus och människa avseende förmågan att reagera på inflammatoriska stimuli.



Studiens resultat visar att i motsats till sjukdomstillståndet hos människa så uppvisar inte mössen I de experimentella modellerna någon synbar eosinofildegranulering i sina luftvägsslemhinnor. Musens blodeosinofiler visar även en sämre förmåga att frisätta sina granula proteiner jämfört med människans eosinofiler. För att klargöra om de underliggande skillnaderna i eosinofilernas förmåga att degranulera in vivo och in vitro beror på skillnader mellan mus och människa eller på otillräcklig stimulering I de djurexperimentella modellerna behövs ytterliggare studier. Vår slutsats är att den hos dessa allergisk möss uppvisdade eosinofilrika inflammationen inte avspeglar den allergiska sjukdomen hos människa. Sålunda är det mycket svårt att genom studier med allergiska musmodeller dra några slutsatser om eosinofilernas roll och påverkan vid allergisk sjukdom i luftvägarns hos människa.



För att undersöka eosinofilernas degranuleringsmekanismer studeras vanligen isolerade blodeosinofiler som efter stimularing in vitro frisätter granulaproteiner. I de flesta sådana studier kan man dock även se en svag frisättning av granula protein från celler som ej blivit stimulerade. Det är tänkbart att eosinofilerna under själva uppreningsprocessen från blodet kan stimuleras så att de börjar degranulera. I den andra delen av denna avhandling undersöks därför om det överhuvudtaget är lämpligt att använda isolerade eosinofiler för att studera övergången från en vilande till en degranulerande eosinofil. För att kunna bedöma om det skett en förändring av cellens struktur efter upprening från blodet krävs först en detaljerad beskrivning på hur ultrastrukturen hos eosinofilerna ser ut i sitt ursprungstillstånd, dvs i blodcirkulationen hos en frisk människa. För att studera eosinofilernas baslinjestruktur i blod togs därför en ny metod fram i syfte att stabilisera cellstrukturerna direkt efter provtagning (genom fixering med cellstabiliserande lösning). Eftersom antalet eosinofiler i blodet normalt är lågt, justerades även prepareringsprocessen så att eosinofilantalet i preparatet koncenrerades.



Studiens resultat visar att traditionellt upprenade humana blodeosinofiler uppvisar kraftiga skador på granulastrukturerna med tydliga tecken på förlust av proteinnehåll. Vi fann att processen där de röda blodkropparna avlägsnas (lysering genom isotonisk ammoniumkloridbehandling eller hypotonisk vattenbehandling) orsakar denna skada. Vidare förvärrades denna skada vid fortsatt separeringsprocess. De synbara granulaförändringarna liknade de som karakteriserar en aktiv degranulering av vävnadseosinofiler vid allergisk sjukdom. Detta resultat uppmanar till försiktighet att dra några slutsatser om den tidiga regleringen av eosinofildegranulering från den stora mängd data som erhållits från tidigare studier, som utförts med redan degranulerade eosinofiler. För att erhålla eosinofiler med minimala granulaförändringar togs därför en alternativ reningsprocess fram där lyseringsmetoden för borrttagning av röda blodkroppar ersattes med en densitets- centrifugering. Med hjälp av denna metod är det nu möjligt att studera uppkomsten och den tidiga regleringen av eosinofilernas degranulering.



Den tredje och sista studien i avhandlingen syftar till att studera om eosinofiler frisätter granulaproteiner redan i blodcirkulationen hos patienter med symptomatisk allergisk sjukdom. Om detta vore fallet skulle en bestämning av degranuleringsnivån kunna avspegla sjukdomsförloppet i vävnaden och vara en värdefull diagnostisk markör. Med hjälp av den framtagna metoden för direkt fixering av blod (studie II) kunde vi studera eventuella avvikelser i cellstruktur hos blodeosinofiler från patienter med olika allergiska sjukdomar av varierande svårighetsgrad. Vi fann dock att blodeosinofilerna vid dessa tillstånd, till skillnad från vävnadseosinofiler, saknar ultrastrukturella tecken på proteinfrisättning från sina granula. Denna skillnad i aktivering visar sålunda att eosinofiler på sin väg från benmärg, via blodcirkulationen, till den sjuka vävnaden befinner sig i olika aktiveringsstadier och därmed kan ha olika funktion samt även vara mer eller mindre mottagliga för farmakologisk behandling. Avsaknaden av eosinofil degranulering i blod trots svår allergisk sjukdom, innebär att man inte bör studera blodeosinofilerna för att dra några slutsatser om degranuleringen i den sjuka vävnaden. Inte heller kan blodeosinofilernas ultrastruktur fungera som markör för den allergiska sjukdomsprocessen.



Sammantaget understyker resultatet av studierna i denna avhandling vikten av att kontrollera och säkerställa degranuleringsnivån av eosinofiler vid olika typer av provtagning och efter olika behandlingar, metodologiska såväl som farmakologiska, för att kunna bestämma eosinofilernas effekter och sålunda roll vid allergisk sjukdom. (Less)
Abstract
In allergic disorders, the eosinophilic granulocytes migrate to affected tissues and release granule proteins with cytotoxic, immunoregulatory, and remodeling-promoting properties. Given that degranulation is reflected by a loss in eosinophil granule density of living cells, or by cell membrane rupture and release of intact granules, these morphological changes may represent a biomarker of the allergic disease. In this thesis, eosinophil structural changes were quantified by transmission electron microscopy. The main objective was to reveal the degranulation status of blood eosinophils during allergic disease, and to determine the eosinophil morphology in common experimental cell- and animal models used for studying eosinophil activation... (More)
In allergic disorders, the eosinophilic granulocytes migrate to affected tissues and release granule proteins with cytotoxic, immunoregulatory, and remodeling-promoting properties. Given that degranulation is reflected by a loss in eosinophil granule density of living cells, or by cell membrane rupture and release of intact granules, these morphological changes may represent a biomarker of the allergic disease. In this thesis, eosinophil structural changes were quantified by transmission electron microscopy. The main objective was to reveal the degranulation status of blood eosinophils during allergic disease, and to determine the eosinophil morphology in common experimental cell- and animal models used for studying eosinophil activation and its pathogenic consequences.



First, the eosinophil ultrastructure in common mouse models of allergic airway inflammation was determined and the relevance of these models to human disease was assessed. Both in vivo and in vitro studies revealed that eosinophil degranulation occurred in human but not in mouse eosinophils. Thus, eosinophil-driven pathologic events, reflecting human allergic disease, should not unconditionally be expected in current mouse models.



Furthermore, the granule structure of isolated human blood eosinophils was studied and compared with the baseline morphology in blood to examine whether the transformation from an intact eosinophil to a degranulating phenotype can be accurately studied in vitro. The standard procedures of erythrocyte lysis were shown to induce artefactual eosinophil degranulation that also increased the susceptibility of cells to further treatment. Hence, caution should be taken when assessing data and concepts generated in the many previous studies on isolated human blood eosinophils. However, by a novel protocol described herein, eosinophils with minimal granule abnormalities can now be recovered and used for studies on the events regulating the early degranulation.



Finally, using a novel approach to assess the ultrastructure of blood eosinophils the degranulation status of circulating eosinophils in a variety of allergic diseases was determined. The results showed that in symptomatic allergic disease, eosinophils retain their granule contents until they have reached their target organ. Hence, eosinophil degranulation in the circulation cannot be used as a biomarker of allergic disease. This finding also suggests that eosinophils in different body compartments have different effector functions and may have distinct susceptibility to therapeutic interventions.



Altogether, this thesis underlines the general importance of validating samples and applied methodology when exploring eosinophil degranulation in vitro or in allergic disease. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
supervisor
opponent
  • Professor Venge, Per, Klinisk kemi, Uppsala universitet.
organization
publishing date
type
Thesis
publication status
published
subject
keywords
blood, histochemistry, cytochemistry, tissue culture, Histologi, cytokemi, histokemi, vävnadskultur, animal morphology, Animal anatomy, Djurs anatomi och morfologi, Haematology, "cytoplasmic granules", Hematologi, Respiratory system, extracellulära vätskor, Andningsorganen, toxikologi, farmaci, farmakognosi, Farmakologi, toxicology, pharmacy, pharmacognosy, Klinisk biologi, Pharmacological sciences, Histology, "cell separation", mice, "animal models", "biological marker", "transmission electron microscopy" allergy, "cell degranulation", Clinical biology, extracellular fluids, eosinophils
pages
112 pages
publisher
Department of Laboratory Medicine, Lund University
defense location
Föreläsningssal 1, Centralblocket, Universitetssjukhuset i Lund.
defense date
2004-03-04 09:00
ISBN
91-85439-00-2
language
English
LU publication?
yes
id
a6afc74b-ba5b-4774-9348-0cadca8dcecc (old id 544367)
date added to LUP
2007-10-13 14:20:16
date last changed
2016-09-19 08:45:15
@misc{a6afc74b-ba5b-4774-9348-0cadca8dcecc,
  abstract     = {In allergic disorders, the eosinophilic granulocytes migrate to affected tissues and release granule proteins with cytotoxic, immunoregulatory, and remodeling-promoting properties. Given that degranulation is reflected by a loss in eosinophil granule density of living cells, or by cell membrane rupture and release of intact granules, these morphological changes may represent a biomarker of the allergic disease. In this thesis, eosinophil structural changes were quantified by transmission electron microscopy. The main objective was to reveal the degranulation status of blood eosinophils during allergic disease, and to determine the eosinophil morphology in common experimental cell- and animal models used for studying eosinophil activation and its pathogenic consequences.<br/><br>
<br/><br>
First, the eosinophil ultrastructure in common mouse models of allergic airway inflammation was determined and the relevance of these models to human disease was assessed. Both in vivo and in vitro studies revealed that eosinophil degranulation occurred in human but not in mouse eosinophils. Thus, eosinophil-driven pathologic events, reflecting human allergic disease, should not unconditionally be expected in current mouse models.<br/><br>
<br/><br>
Furthermore, the granule structure of isolated human blood eosinophils was studied and compared with the baseline morphology in blood to examine whether the transformation from an intact eosinophil to a degranulating phenotype can be accurately studied in vitro. The standard procedures of erythrocyte lysis were shown to induce artefactual eosinophil degranulation that also increased the susceptibility of cells to further treatment. Hence, caution should be taken when assessing data and concepts generated in the many previous studies on isolated human blood eosinophils. However, by a novel protocol described herein, eosinophils with minimal granule abnormalities can now be recovered and used for studies on the events regulating the early degranulation.<br/><br>
<br/><br>
Finally, using a novel approach to assess the ultrastructure of blood eosinophils the degranulation status of circulating eosinophils in a variety of allergic diseases was determined. The results showed that in symptomatic allergic disease, eosinophils retain their granule contents until they have reached their target organ. Hence, eosinophil degranulation in the circulation cannot be used as a biomarker of allergic disease. This finding also suggests that eosinophils in different body compartments have different effector functions and may have distinct susceptibility to therapeutic interventions.<br/><br>
<br/><br>
Altogether, this thesis underlines the general importance of validating samples and applied methodology when exploring eosinophil degranulation in vitro or in allergic disease.},
  author       = {Malm-Erjefält, Monika},
  isbn         = {91-85439-00-2},
  keyword      = {blood,histochemistry,cytochemistry,tissue culture,Histologi,cytokemi,histokemi,vävnadskultur,animal morphology,Animal anatomy,Djurs anatomi och morfologi,Haematology,"cytoplasmic granules",Hematologi,Respiratory system,extracellulära vätskor,Andningsorganen,toxikologi,farmaci,farmakognosi,Farmakologi,toxicology,pharmacy,pharmacognosy,Klinisk biologi,Pharmacological sciences,Histology,"cell separation",mice,"animal models","biological marker","transmission electron microscopy" allergy,"cell degranulation",Clinical biology,extracellular fluids,eosinophils},
  language     = {eng},
  pages        = {112},
  publisher    = {ARRAY(0x8117af8)},
  title        = {Assessment of eosinophil degranulation in allergic diseases and experimental models},
  year         = {2004},
}