Advanced

Protein Microarrays Based on Single Framework Recombinant Antibody Fragments (SINFABS) - Catcher and Carrier - A Crucial Combination

Steinhauer, Cornelia LU (2005)
Abstract (Swedish)
Popular Abstract in Swedish

?DNA-mikromatriser eller genchips? är idag väletablerade verktyg inom biologisk forskning och klinisk diagnostik. Genmikromatriser kan exempelvis användas för att i mikroskala studera genetiska skillnader mellan sjuka och friska vävnader. Informationen som då erhålls kan ge värdefulla upplysningar om sjukdomens natur och användas vid utveckling av nya läkemedel.



Generna innehåller all information som cellerna behöver för att fungera, men proteinerna är de verkliga effektormolekylerna som utför aktiviteterna. För att få en komplett bild av en sjukdom måste följaktligen, förutom generna, även proteinerna studeras. I motsats till utvecklingen av DNA-mikromatriser, är... (More)
Popular Abstract in Swedish

?DNA-mikromatriser eller genchips? är idag väletablerade verktyg inom biologisk forskning och klinisk diagnostik. Genmikromatriser kan exempelvis användas för att i mikroskala studera genetiska skillnader mellan sjuka och friska vävnader. Informationen som då erhålls kan ge värdefulla upplysningar om sjukdomens natur och användas vid utveckling av nya läkemedel.



Generna innehåller all information som cellerna behöver för att fungera, men proteinerna är de verkliga effektormolekylerna som utför aktiviteterna. För att få en komplett bild av en sjukdom måste följaktligen, förutom generna, även proteinerna studeras. I motsats till utvecklingen av DNA-mikromatriser, är teknologiutvecklingen av proteinmikromatriser inte lika enkel. En förklaring till detta är att proteiner, till skillnad från gener, är betydligt mer komplexa och heterogena molekyler, vilket bland annat gör dem svårare att immobilisera på en chipyta så att de fortfarande är aktiva. Vi har valt att använda oss av antikroppar på våra mikromatriser. Antikroppar är en viktig beståndsdel i vårt immunförsvar och de har en unik förmåga att specifikt binda till skadliga ämnen som sedan kan oskadliggöras. Det är just denna förmåga att specifikt kunna binda till en analyt som vi använder oss av. Vid tillverkningen av en antikroppsbaserad mikromatris sätts antikropparna ut en och en i ett bestämt mönster, en så kallad matris, på en fast yta. I varje punkt finns det sålunda en antikropp som kan binda till en unik analyt. Genom att detektera till vilka antikroppar som provets olika beståndsdelar binder till kan man bestämma proteinsammansättningen i ett prov. I likhet med DNA-mikromatriserna, kan antikroppsmatriserna användas till att identifiera upp- och nedreglerade proteiner i exempelvis sjuka respektive friska prov/vävnader. De differentiellt uttryckta proteinerna som upptäcks kan sedan användas för att studera biologin bakom sjukdomen, ställa diagnos av sjukdomen samt för att utveckla nya terapeutiska läkemedel.



Målet med min avhandling har varit att utveckla en teknologiplattform baserad på antikroppsmikromatriser som är jämförbar med dagens DNA-mikromatriser. Arbetet har fokuserats på två av nyckelkomponenterna, nämligen antikroppen som fångarmolekyl och chipytan, d.v.s. ?fångare och bärare?. Istället för att använda naturligt förekommande antikroppar så har vi valt att använda oss av genetiskt modifierade antikroppar, så kallade ?single framework recombinant antibody fragments? (sinFabs). Fördelen med dessa är att de är mer strukturellt homogena, enklare och snabbare att producera och dessutom finns de redan idag tillgängliga med i stort sett alla möjliga bindningsspecificiteter. Studierna presenterade i denna avhandling visade att sinFabs är utmärkt lämpade som fångarmolekyler på mikromatriserna. Till skillnad från många av de naturligt förekommande antikropparna kunde sinFab-antikropparna immobiliseras på chipytan utan att förlora sin aktivitet och inbindningsförmåga. SinFab-antikropparna uppvisade hög specificitet och känslighet vilket gjorde det möjligt att även analysera komplexa prover, d.v.s. prov bestående av tusentals olika analyter (t.ex. ett blodprov), och där mängden av de analyter man letade efter var väldigt låga. SinFabs-matriserna kunde dessutom lagras i över ett år utan att funktionaliteten hos antikropparna försämrades. I förlängningen innebär denna imponerande stabilitet att antikroppsmatriser baserade på sinFab-molekyler skulle kunna produceras i stor industriell skala och därefter förvaras under lång tid i väntan på att användas.



Utvärdering och val av chipyta var däremot mer problematiskt. Trots att flertalet kommersiella och egenutvecklade ytor utvärderades som bärare för antikroppsmatriserna, var det ingen yta som var överlägsen de andra. Däremot identifierades flertalet viktiga ytegenskaper som påverkade sinFab-antikropparna egenskaper, t.ex. en chipytans struktur (1-, 2- eller 3-dimensional) och vilken kemi som används för att koppla antikropparna till ytan (adsorption, kovalent koppling eller affinitets koppling). Under arbetet tillverkades dessutom en helt ny 3-dimensionell yta. Det faktum att ytan utgjordes av en 3-dimensionell struktur medförde att många fler antikroppar per ytenhet kunde bindas (än om en vanlig plan yta hade använts), vilket i slutänden resulterade i väldigt känslig analyser.



Normalt så måste antikropparna renas upp innan de kan immobiliseras på en chipyta. Detta är en tidskrävande och kostsam process som gör det svårt att skala upp storleken på mikromatriserna. Möjligheten att just kunna skala upp sina mikromatriser är vital i det fortsatta utvecklingsarbetet av mikromatristeknologin. I mitt avhandlingsarbete kunde jag också visa att man genom att kombinera modifierade sinFab-antikroppar med en matchande yta så kunde antikropparna tillsättas direkt efter att ha producerats i bakterier utan att först behöva renas upp. Ur en teknologisk synvinkel var detta ett stort steg framåt i det utmanande och viktiga arbetet med att skala upp antikroppsmikromatriserna. (Less)
Abstract
Antibody-based microarrays are among the novel class of rapidly evolving proteomic technologies. In recent years, antibody microarrays have emerged as a unique tool for high-throughput protein expression profiling with great promise within biomedicine and a wide range of potential applications, including disease diagnostics and biomarker discovery. In order to evolve the technology from small dedicated microarrays to high-density well-performing arrays for true global proteome analysis, this thesis focussed on the design of the two key components of the antibody microarray setup: the probe and the solid support, i.e. ?catcher and carrier?. The thesis is based upon five original papers that deal with i) the central features of the probe... (More)
Antibody-based microarrays are among the novel class of rapidly evolving proteomic technologies. In recent years, antibody microarrays have emerged as a unique tool for high-throughput protein expression profiling with great promise within biomedicine and a wide range of potential applications, including disease diagnostics and biomarker discovery. In order to evolve the technology from small dedicated microarrays to high-density well-performing arrays for true global proteome analysis, this thesis focussed on the design of the two key components of the antibody microarray setup: the probe and the solid support, i.e. ?catcher and carrier?. The thesis is based upon five original papers that deal with i) the central features of the probe (on-chip functionality and stability, sensitivity and immobilisation strategies) and ii) the biocompatibility of the solid support (defined by the spot morphology, binding capacity, signal to noise ratio, dynamic range, sensitivity, reproducibility and the long-term performance). Single-framework recombinant antibody fragments (sinFabs), selected from the nCoDeR-library, were found to fulfil most, if not all, of the prerequisites required by well-performing probes for high-density antibody microarrays. In more detail, sinFabs were shown to be functional and stable on the chip with a constant on-chip performance (paper I and II) and to provide sensitive detection of low-abundant analytes (paper III). Furthermore, they could be genetically engineered for improved affinity coupling, thereby enabling non-purified probes to be coupled in an orientated way and purified directly on the chip (paper III and IV). Although sinFab microarrays were shown to be biocompatible with several commercially available and in-house designed solid supports of different structure (1-, 2- and 3-dimensional) and coupling chemistry (adsorption, covalent coupling and affinity binding), no single surface was found to fulfil all the requirements for a sensitive and high-density antibody microarray analysis (paper II and V). Thus, the development of a novel highly biocompatible macroporous silicon support coated with nitrocellulose (MAP3-NC7) (paper V) was a first step towards the specific design of optimised antibody microarray supports. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
supervisor
opponent
  • Dr. Hoheisel, Jörg, Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), Heidelberg, Germany
organization
publishing date
type
Thesis
publication status
published
subject
keywords
Immunology, serology, transplantation, Immunologi, serologi, probe, coupling chemistry, solid support, stability, scFv, antibody microarray, protein microarray, Biotechnology, Bioteknik
pages
128 pages
publisher
Department of Immunotechnology, Lund University
defense location
Lundmarksalen Astronomic Institute Sölvegatan 27 Lund
defense date
2005-12-16 13:15
ISBN
91-7422-100-0
language
English
LU publication?
yes
id
34b38b30-7926-4d3b-be18-4e6e97c97e27 (old id 545902)
date added to LUP
2007-09-10 14:32:10
date last changed
2016-09-19 08:45:08
@misc{34b38b30-7926-4d3b-be18-4e6e97c97e27,
  abstract     = {Antibody-based microarrays are among the novel class of rapidly evolving proteomic technologies. In recent years, antibody microarrays have emerged as a unique tool for high-throughput protein expression profiling with great promise within biomedicine and a wide range of potential applications, including disease diagnostics and biomarker discovery. In order to evolve the technology from small dedicated microarrays to high-density well-performing arrays for true global proteome analysis, this thesis focussed on the design of the two key components of the antibody microarray setup: the probe and the solid support, i.e. ?catcher and carrier?. The thesis is based upon five original papers that deal with i) the central features of the probe (on-chip functionality and stability, sensitivity and immobilisation strategies) and ii) the biocompatibility of the solid support (defined by the spot morphology, binding capacity, signal to noise ratio, dynamic range, sensitivity, reproducibility and the long-term performance). Single-framework recombinant antibody fragments (sinFabs), selected from the nCoDeR-library, were found to fulfil most, if not all, of the prerequisites required by well-performing probes for high-density antibody microarrays. In more detail, sinFabs were shown to be functional and stable on the chip with a constant on-chip performance (paper I and II) and to provide sensitive detection of low-abundant analytes (paper III). Furthermore, they could be genetically engineered for improved affinity coupling, thereby enabling non-purified probes to be coupled in an orientated way and purified directly on the chip (paper III and IV). Although sinFab microarrays were shown to be biocompatible with several commercially available and in-house designed solid supports of different structure (1-, 2- and 3-dimensional) and coupling chemistry (adsorption, covalent coupling and affinity binding), no single surface was found to fulfil all the requirements for a sensitive and high-density antibody microarray analysis (paper II and V). Thus, the development of a novel highly biocompatible macroporous silicon support coated with nitrocellulose (MAP3-NC7) (paper V) was a first step towards the specific design of optimised antibody microarray supports.},
  author       = {Steinhauer, Cornelia},
  isbn         = {91-7422-100-0},
  keyword      = {Immunology,serology,transplantation,Immunologi,serologi,probe,coupling chemistry,solid support,stability,scFv,antibody microarray,protein microarray,Biotechnology,Bioteknik},
  language     = {eng},
  pages        = {128},
  publisher    = {ARRAY(0x8d3da28)},
  title        = {Protein Microarrays Based on Single Framework Recombinant Antibody Fragments (SINFABS) - Catcher and Carrier - A Crucial Combination},
  year         = {2005},
}