Production and characterisation of cellulose Binding Domain tagged Amelogenin

Abstract

The use of fusion proteins has become prevalent within
biotechnical applications, offering a method of supplementing a protein
with physical or chemical properties inherent to multiple full size proteins
or peptides. The thesis work presented in this report was designed to
attempt such a fusion, between a recombinant human amelogenin and a
fungal cellulose binding domain peptide.
The extracellular matrix protein, amelogenin is commonly
associated with early tooth development and enamel formation in a large
variety of mammals. Amelogenin possesses a pH dependent ability to
assemble into higher order structures comprised of a large amount of
protein molecules, and depending on experimental conditions, this nanostructure
may be a spherical or rod-like shape.
Cellulose binding domains, or CBDs, are peptides generally
present on cellulose degrading enzymes, cellulases, and afford the enzyme
an increased affinity for insoluble cellulose, through a semi-permanent
adsorption.
This report has been focused on attempting a fusion protein of
amelogenin and a CBD, herein referred to as rh174CBD, and
determining changed, retained and supplemented protein properties.
Amongst these analyses are: pH dependent solubility, the quaternary
structure formation of amelogenin and adsorption capabilities to cellulose.
rh174CBD presented changed solubility characteristics when
compared to the non-tagged analogue, rh174. The solubility profile was
shifted towards higher pH, resulting in a comparably low solubility at
physiological pH.
A dynamic light scattering analysis on the rh174CBD provided
evidence of an inability to assemble into nano-spheres at previously
studied, physiological pH. However, at alkaline pH, the fusion protein
assembled into particles, highly similar in size to those of rh174.
ii
Analyses of the protein’s ability to adsorb to cellulose have shown a
clear trend in which rh174CBD adsorption to cellulose greatly surpasses
that of rh174. Furthermore, the experimental details have been analysed
to some extent, providing data, which suggests that binding efficacy is
increased at alkaline pH.
Adsorption ability of protein mixtures containing both rh174CBD
and rh174 were assessed, resulting in adsorption averages exceeding those
of the summed subset contributions of rh174CBD adsorption percentage
and non-specific binding.
The results present conclusive evidence of the ability to create a
functional amelogenin fusion protein. rh174CBD remains stable and
functional at highly alkaline pH and retains its inherent ability of nanoparticle
assembly. Furthermore, this report provides the first conclusive
evidence of compound amelogenin nano-sphere assembly, comprised of
tagged and non-tagged amelogenin. Hence, the results provide a proof of
concept for future functionalization of amelogenin nano-spheres,
consisting of various tagged protein types.

Popular Abstract (Swedish)

Proteiner är kroppens byggstenar och verktyg, som bland annat
bygger upp håret på vårt huvud och ser till så att vår matsmältning fungerar,
men det är långt ifrån allt. Denna mångfald bland proteinerna har lett till
att man börjat använda dem inom en mängd olika områden, dels för att
effektivisera gamla metoder, men också till helt nya produkter.
För att producera proteiner som har förmågan att revolutionera
dagens industri, teknik och sjukvård, använder sig många forskare av
tekniker som kan förflytta genetisk kod, DNA, från en levande organism,
till en annan. På detta sätt kan man få en bakterie eller jästcell att tillverka
ett nyttigt protein som vi sen kan använda. På så sätt kan man idag till
exempel producera insulin, för vård av diabetiker, på ett effektivt och säkert
sätt.
En möjlighet som uppstår från denna typ av forskning är att skapa
nya, sammansatta proteiner, s.k. fusionsproteiner, som genom
sammanfogning kan få egenskaper från de båda ursprungsproteinerna. Det
presenterade examensarbetet designades med avsikt att utvärdera ett sådant
fusionsprotein, bestående av proteinet Amelogenin och en kort
proteinkedja, en peptid, med förmågan att fästa till cellulosa, ursprungligen
från ett annat protein.
Bland alla de olika proteiner som skapas i våra kroppar finns det
ett protein som kallas för Amelogenin. Detta protein utsöndras från celler i
vår käke när vi som barn får tänder, och proteinet bidrar till att skapa
emaljen som gör ytan på våra tänder så hård. Förutom detta har forskare
upptäckt att Amelogenin bildar små sfärer som inte är mer än 30
nanometer breda, det vill säga 30 miljonte delar av en millimeter. Dessa
sfärer är alltså vad man skulle kunna beskriva som biologiska nanopartiklar.
Den korta proteinkedjan som binder till cellulosa kommer
ursprungligen från ett protein som bryter ner cellulosa, en huvudsaklig
beståndsdel i växter och träd. Den använda peptiden binder in till
cellulosan och gör på så sätt att ursprungsproteinet kommer tillräckligt nära
och håller sig kvar tillräckligt länge, för att bryta ner växtmaterialet. Denna
typ av peptid kallas också för Cellulosa Bindande Domäner, CBD’er.

Fokus

Fokus i denna rapport låg i att skapa fusionsproteinet rh174CBD,
bestående av Amelogenin och en CBD, samt att utvärdera förändrade,
bevarade och förvärvade egenskaper hos det nya proteinet. Dessutom
undersöktes möjligheten att skapa en nanopartikel bestående av både de nya
och de ursprungliga Amelogenin proteinerna.

Resultat och diskussion

Det finns två intressanta egenskaper hos Amelogenin som
undersöktes för det nya proteinet. Den ena är den, tidigare nämnda
förmågan att bilda nanosfärer, den andra är hur lösligt proteinet är i olika
sura eller basiska vätskor. Utöver dessa bedömdes också fusionsproteinets
förmåga att binda in till cellulosa och om det tillsammans med vanligt
Amelogenin kan skapa nanosfärer bestående av de båda proteintyperna.
Jämfört med det normala Amelogeninet hade den förändrade
varianten en lägre löslighet vid fysiologiskt pH, det pH som finns i den
mänskliga kroppen. Dessutom bildades inga nanosfärer av fusionsproteinet
vid detta pH-värde. Däremot ökades lösligheten vid högre pH och
dessutom bildades nanosfärer med samma storlek som man förr sett hos
vanliga Amelogenin.
När kraven för bildandet av nanosfärer hade bestämts testades
förmågan att binda in, adsorbera, till cellulosa. Testerna visade att
nanopartiklar skapade med fusionsproteinet kunde adsorbera till cellulosa
med i genomsnitt 80 procents effektivitet. Detta jämfördes med vanligt
Amelogenin som bara band in med 5 procent under samma
omständigheter.
Om man blandar de båda proteinerna och sen ökar pH skapas
sammansatta nanopartiklar, bestående av de båda proteintyperna. Detta
bestämdes med hjälp av ett flertal tester, och det experiment som slutligen
fastställde slutsatsen framställs i figurerna nedan. I den första figuren visas
minskningen av obundet protein i vätskan runt cellulosan. Denna
minskning innebär att protein bundit in till cellulosan och i figuren ser man
att när andelen av fusionsproteinet ökar i blandningen ökar också andelen
adsorberat protein. I den andra figuren ser vi istället procentandelen bundet
protein för de olika blandningarna och jämför det med den förväntade
adsorptionskurvan, som baseras på de genomsnittliga inbindningseffekterna
från de båda proteinerna. På detta sätt bevisas att den genomsnittliga
mängden adsorberat protein är högre än summan av den bidragande
faktorn från andelen rh174CBD summerat med den för ospecifik
inbindning. Vilket bara hade kunnat hända om proteinerna tillsammans
bildar sammansatta nanopartiklar.

Figur 1. Ursprungskoncentration och koncentration av obundet protein
efter inbindningsförsök av proteinblandningar med olika andelar av
fusionsproteinet (överst) samt procentandel av inbundet protein
jämfört mot förväntad adsorptionskurva (nederst). *Se PDF*

Resultaten från detta examensarbete erbjuder fullständiga bevis för
möjligheten att skapa funktionella fusionsproteiner med Amelogenin. Det
skapade, rh174CBD, består och förblir funktionellt i högt basiska
förhållanden, och bibehåller dessutom sin förmåga att sammanfogas till
nanopartiklar.
Detta arbete bidrar med de första fullständiga bevisen för
skapandet av funktionaliserade nano-partiklar bestående av en
sammansättning av nativt, rekombinant Amelogenin och en modifierad typ
av detsamma. Därmed bestyrker dessa resultat konceptet av att i framtiden
skapa biologiskt nedbrytbara, funktionella, Amelogenin nanopartiklar,
bestående av ett flertal modifierade varianter av proteinet.

• author: Butler, Samuel
• supervisor: Johan Svensson Bonde
• organization: Pure and Applied Biochemistry
• course: KBK820 20152
• year: 2015
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Technology and Engineering; Chemistry
• keywords: tillämpad biokemi, applied biochemistry, Molecular biotechnology, Nano-particle, Amelogenin, Cellulose Binding Domain
• language: English
• id: 8514032
• date added to LUP: 2016-01-08 09:31:56
• date last changed: 2016-01-08 09:31:56